РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Програма та загальна методика досліджень
Дослідження Са2+-транспортувальних систем секреторних клітин проводили в умовах in vitro на ізольованих шлункових залозах морських свинок та, частково, на ізольованих мітохондріях печінки білих щурів. Експериментальні дослідження передбачали з'ясування ролі енергозалежних Са2+-транспортувальних систем у підтриманні функціонального стану секреторних клітин шлункових залоз, їх значення у порушенні секреторної функції цих залоз, а також аналіз взаємодії цих іон-транспортувальних систем з катіонами лужноземельних і перехідних металів. Основні експериментальні дослідження були спрямовані на з'ясування фізико-хімічних механізмів вибіркової транслокації Са2+ енергозалежними Са2+-транспортними системами секреторної клітини та інгібування їх катіонами інших лужноземельних і перехідних металів. Одним із важливих підходів, запропонованим нами [26, 27, 33] для вивчення цих питань є пригнічення транслокації кальцію Са2+-транспортувальними системами катіонами інших металів та аналіз залежності інгібувальних ефектів цих катіонів від їхніх фізико-хімічних параметрів. Для дослідження був підібраний ряд катіонів лужноземельних і перехідних металів (Ba2+, Sr2+, Mn2+, Co2+, Ni2+, Cd2+, La3+), які подібно до іонів Са2+ легко утворюють координаційні зв'язки з багатьма органічними лігандами і водночас характеризуються неоднаковими фізико-хімічними параметрами - радіусом іона, ентальпією гідратації, спорідненістю до функціонально важливих груп біолігандів (карбоксильних, сульфгідрильних, фосфатних і ін.) [69, 70, 112]. При підборі катіонів металів враховували також дані літератури, щодо їх здатності інгібувати Са2+-транспортувальні системи, або ж транспортуватись за їх участю через клітинні мембрани [146, 269, 296, 582, 583]. В цілому програма досліджень включала такі основні етапи:
1. Виділення та морфофункціональна характеристика ізольованих шлункових залоз з інтактними і пермеабілізованими плазматичними мембранами секреторних клітин; виділення і морфофункціональна характеристика ізольованих мітохондрій печінки.
2. Аналіз ролі позаклітинного і внутрішньоклітинного кальцію в регуляції секреторної функції ізольованих шлункових залоз.
3. Функціональна характеристика енергозалежних Са2+-транспортувальних систем плазматичної і внутрішньоклітинних мембран секреторних клітин ізольованих шлункових залоз.
4. Дослідження закономірностей порушення секреторної функції ізольованих шлункових залоз катіонами перехідних металів, залежно від їх виду і концентрації у середовищах інкубації.
5. Інгібіторний аналіз взаємодії катіонів лужноземельних і перехідних металів з Са2+-помпами плазматичної і ретикулярної мембран секреторних клітин ізольованих шлункових залоз.
6. Інгібіторний аналіз взаємодії катіонів лужноземельних і перехідних металів з Na+-Ca2+-обмінником плазматичної мембрани секреторних клітин ізольованих шлункових залоз.
7. Інігібіторний аналіз взаємодії катіонів лужноземельних і перехідних металів з мітохондріальними Са2+-транспортувальними системами - Са2+-уніпортером і Са2+-Н+-обмінником внутрішньої мембрани мітохондрій.
8. Математичний аналіз залежності ефективності інгібування енергозалежних Са2+-транспортувальних систем секреторної клітини катіонами металів від їхніх фізико-хімічних параметрів (кристалографічного радіуса, ентальпії гідратації, констант стійкості комплексів металів з кисне- і сірковмісними лігандами).
Ізольовані шлункові залози виділяли із шлунка морських свинок масою 400-500 г за методом Т.Берліндха і К.Обрінк [134] з окремими нашими модифікаціями [21, 52]. Морфофункціональний аналіз стану ізольованих шлункових залоз проводили з використанням методів світлової мікроскопії, а також за даними функціональних тестів. Зокрема аналізували інтенсивність дихання ізольованих залоз, яке реєстрували полярографічним методом [5, 21], та секреторну реакцію цих залоз на стимулятори секреції (карбахолін) [21]. Пермеабілізацію клітин ізольованих шлункових залоз здійснювали з використанням неіонного детергента - дигітоніну [23]. Повноту пермеабілізації оцінювали за фарбуванням клітин трипановим синім та за інтенсивністю виділення клітинами цитозольного фермента - лактатдегідрогенази. Мітохондрії виділяли із печінки білих щурів методом диференціального центрифугування [30, 57, 521]. Морфофункціональний аналіз стану ізольованих мітохондрій проводили методом електронної мікроскопії, а також на основі інтенсивності дихання і окисного фосфорилювання та поглинання ними кальцію, що реєстрували полярографічним методом [189].
Роль позаклітинного і внутрішньоклітинного кальцію в регуляції секреторної функції ізольованих шлункових залоз досліджували за секреторною реакцією цих залоз на карбахолін за різних концентрацій позаклітинного кальцію у середовищі інкубації, та під впливом індукторів вивільнення кальцію із внутрішньоклітинних депо - кофеїну [250, 257, 409] та інозитол-1,4,5-трифосфату [140, 542, 557].
Значення енергозалежних Са2+-транспортувальних систем у підтриманні функціонального стану секреторних клітин ізольованих шлункових залоз оцінювали за секреторною реакцією цих залоз після селективного інгібування або зміни режиму роботи цих іон-транспортувальних систем. Зокрема для інгібування Са2+-помпи плазматичної і ретикулярної мембран секреторних клітин шлункових залоз використовували ортованадат натрію [61, 447]. Дослідження функціональної ролі Nа+-Са2+-обмінника у секреторних клітинах шлункових залоз проводили за умов зниження трансмембранного градієнту іонів Nа+ на плазматичній мембрані цих клітин шляхом інкубації їх у гіпонатрієвих середовищах, або ж у середовищах з натрій-селективним іонофором монензином [66] та інгібітором Nа+-К+-помпи - строфантином G [67, 68]. Дослідження можливої ролі мітохондрій у регуляції внутрішньоклітинного кальцію в секреторних клітинах шлункових залоз та їхньої функціональної активності проводили за умови інгібування Са2+-уніпортера м
- Київ+380960830922