РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Характеристика объекта и предмета исследования
Предметом исследования являлось формообразование мицелия микроскопических грибов в условиях глубинного культивирования. Исследования проводили на примере Thielavia terrestris (Apinis) Malloch et Cain, продуцент кормового белка [16], Cladosporium cladosporioides (Fresen) de Vries - продуцент меланина и его alb-мутант, полученный при облучении конидий родительского штамма высокими дозами ? -лучей [48], а также Cladosporium herbarum (Pers.: Fries) Link, 1453, Cladosporium sphaerospermum Penzig 1059, Apiospora montagnei Sac. 2416, Ulocladium botrytis Preuss, 2075 из коллекции отдела физиологии и систематики микромицетов ИМВ НАНУ и Chaetomium globosum Kunze: Fries 209 (ВКМ).
2.2. Условия культивирования микромицетов
Культивирование микромицетов проводили в периодических и непрерывных условиях, в колбах на круговых качалках и в ферментёрах "АНКУМ-2" и "Вiotec" на жидкой среде Чапека. В случае непрерывного культивирования скорость разбавления составляла - 0,05 ч-1. Стационарное состояние контролировали по концентрации кислорода. При исследовании влияния массообмена на эффективность процесса обороты мешалки изменяли в диапазоне 120-440 об/мин. Исследование энергетической эффективности роста и непродуктивных затрат проводили при трёх типах С-лимита: в стационарной фазе периодической культуры, при лимитировании углеродным субстратом в режиме хемостата и в условиях глубокого лимитирования после остановки протока и выхода СО2 в постоянный режим. Пеллетный и нитчатый рост получали путём изменения рН среды, температуры, концентрации инокулюма.
Исследование ростовых характеристик T. terrestris на плотной питательной среде проводили, используя пластинки кремнекислого геля, пропитанного жидкой средой Чапека. В качестве источника углерода применяли глюкозу в концентрации 0,005 - 40 г/л. Контролем служила пластинка кремнекислого геля, пропитанная средой без глюкозы. После пропитки чашки Петри с гелем стерилизовали при 0,5 атм. 30 мин, после чего инокулировали споровой суспензией (уколом в центр чашки). Время инкубации - 5 суток, температура - 37 oС. Диаметр колонии измеряли в двух направлениях через каждые 24 часа.
2.3. Исследуемые физиологические показатели
Физиологические показатели (экономический коэффициент, метаболический коэффициент, коэффициент поддержания) рассчитывали на основании полученных экспериментальных данных по известным формулам [86]. Апикальную скорость роста определяли при прорастании конидий, ориентированных на пеллетный и нитчатый рост - в препарате "висячая капля", измеряя длину гифы через определённые временные интервалы.
Энергетическую эффективность роста (?) рассчитывали описанным способом [7]. Экспериментальные данные для расчёта получали, используя импульсный метод подпитки различными источниками углерода (по 5 - 10 мл 5 %-ного раствора глюкозы, лактозы, ксилозы, ацетата и этанола), измеряя при этом концентрацию кислорода в выходящем из ферментёра воздухе. Непродуктивные затраты (?) вычисляли как разницу между единицей и энергетической эффективностью роста.
Измерение интенсивности дыхания проводили газо-балансовым методом с помощью пульта газоанализаторов ПГА- (производства экспериментального электромеханического завода физико-энергетического института, Латвия). Биологическое потребление кислорода определяли путём интегрирования кривой интенсивности изменения концентрации кислорода.
Радиальную скорость роста рассчитывали по уравнению:
Кr = rt - r0 /t - t0
где r0 - радиус колонии при t0, rt - радиус колонии при t.
Для определения концентрационной константы насыщения (Кs) использовали графический метод Лайнуивера-Берка.
Периферическую зону роста определяли морфометрическим методом с покровными стёклами [138]. Удельную скорость роста ? рассчитывали по формуле, предложенной Тrinci [364]:
? = 2(ln rt -ln r0)/t.
Интенсивность эндогенного дыхания в интактной грибной культуре определяли полярографическим методом (полярограф LP-7) в 0,2 М фосфат цитратном буфере в диапазоне рН 2,5 - 8,0. Уровень эндогенного дыхания выражали в н.г-атомах О2 мг-1 белка мин-1. При изучении экзогенного дыхания мицелий соответствующей формы гриба после 3-х суточного культивирования отмывали физ. раствором и помещали в поляризационную ячейку. В качестве субстрата вносили глюкозу в концентрации от 2 до 10 мМ.
Для исследования цианидрезистентного дыхания в реакционную смесь вводили 1 мМ КСN. Опыты проводили в специальной термостатированной ячейке при температуре 37 ?С для Thielavia terrestris и 28 ?С для Chaetomiun globosum в 0,2 М натрий-фосфатном буфере. Значения рН устанавливали согласно условиям опытов. Пеллетный и нитчатый мицелий получали благодаря заданому значению рН среды.
2.4. Определение биохимических показателей
Определение АТФ проводили биолюминесцентным методом на LKB-люминометре [354], предварительно отмыв интактный мицелий от культуральной жидкости и обработав его 5 % раствором трихлоруксусной кислоты [252]. Пул эндогенного цАМФ и цГМФ определяли, используя набор реактивов "Amersham". Подготовка проб мицелия и конидий проводилась согласно методике, описанной Scott, Solomon, [331].
Биомассу определяли весовым методом, содержание белка - по Барштейну и Лоури, кислотность культуральной жидкости - потенциометрически [30], концентрацию глюкозы - по Samner [326]. Содержание меланина оценивали по количеству парамагнитных центров методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) и выражали в спин/г АСБ [47].
Качественные реакции на летучие кислоты проводили в отгоне согласно принятым методам [12].
Содержание углерода в биомассе и культуральной жидкости устанавливали путём сжигания образцов в токе кислорода, с последующим измерением объёма углекислого газа в анализаторе углерода АН7560 (Гомельский завод измерительных приборов). Содержание метаболитов в культуральной жидкости рассчитывалось