РОЗДІЛ 2. ПРЕДМЕТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Предмет дослідження
З метою одержання лектинів досліджувались та використовувались рослини
переважно Прикарпатського регіону та Карпат, а також вищі гриби Карпат та ікра
риб. При цьому використовувались різні органи рослин – насіння, кора, надземна
частина (трава або листя), підземні органи (цибулини, бульби, корені,
кореневища). У вищих грибів предметом досліджень були плодові тіла. Частини
рослин та плодові тіла грибів використовували свіжими або висушували при
температурі до +60оС.
Безпосереднім предметом досліджень були:
-рослинні джерела лектинів: кореневище купини Polygonatum multiflorum (L.) All.
та P. verticillatum (L.) All. , Paris quadrifolia L., кора та насіння Laburnum
anagyroides Medik., кори Caragana arborescens Lam., Sarothamnus scoparius (L.)
Koch., Robinia pseudoacacia L., насіння Amaranthus caudatus L., A. retroflexus
L., Aesculus hippocastanum L., надземна частина Galanthus nivalis L., Leucoum
vernum L., Hieracium aurantiacum L., H. pilosella L., H sylvularum Jord ex
Boreau, Equisetum arvense L., Echinacea purpurea (L.) Moench.) та Rudbeckia
laciniata L.;
- грибні джерела лектинів: плодові тіла Aleuria aurantia (Fr.)Tekl, Peziza
badia Merat, P. verticulosa St. Am., Boletus luridus Fr., Amanita phalloides
(Vaill. Fr.) Secr., Sarcoscypha coccinea (Fr.) Lambette, Clitocybe nebularis
(Fr.) Kumm.;
- джерела лектинів з ікри риб: Persa fluviatilis L. та Lucioperca lucioperca
/L./;
- лектини, одержані з вказаних вище джерел;
- гісто- та цитологічні препарати нормальних та трансформованих тканин і
клітин, клітини лейкемії миші ліній L929, L1210, MCF-7 (wt), MCF-7 (OOX/R).
2.2. Виявлення лектинів в біологічному матеріалі.
2.2.1. В и я в л е н н я л е к т и н і в з а д о п о м о г о ю р е а к ц і ї г
е м а г л ю т и н а ц і ї т а п р е ц и п і т а ц і ї. У роботі ми
використовували наступну методику постановки реакції гемаглютинації [75].
До серії послідовних двократних розведень у мікропробірках лектину або
екстракту, додавали 2 %-ну суспензію еритроцитів у забуференому фізіологічному
розчині (ЗФР), і після 10-ти хвилинної інкубації пробірки центрифугували 30
секунд при 500 g i результат аглютинації спостерігали візуально (неозброєним
оком або під мікроскопом). Аглютинація (позитивний результат) характеризується
утворенням згустка еритроцитів, який не розпадається при обережному збовтуванні
пробірки; при відсутності ж аглютинації еритроцити при збовтуванні підіймаються
з дна пробірки кожен окремо, без утворення згустка (негативний результат).
Суспензію еритроцитів людини готували шляхом відмивання їх від плазми або
сироватки крові ЗФР. 5-10 крапель крові з проколу пальця або вени вуха кролика
збирають у пробірку з 10 мл ЗФР, перемішують і через 10 хв центрифугували при
1000 -1500 g протягом 5-ти хв. ЗФР має такий склад: в 1 л дистильованої води
8,0 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,15 г Na2HPO4 x2H2O; рН після розчинення солей
доводили до 7,4 за допомогою 1 н. НСl або NaOH. Еритроцити 2 рази відмивали
ЗФР, після чого визначали їхній вміст у суспензії за допомогою гематокрита і
розбавляли сольовим розчином до 2 % концентрації. Цю суспензію можна зберігати
в холодильнику протягом тижня.
Окрім нативних еритроцитів, іноді нами застосовувались еритроцити, оброблені
ферментами - найчастіше трипсином або папаїном. Такі еритроцити, як правило,
чутливіші до дії лектинів, хоча їхня чутливість залежить від вуглеводної
специфічності лектинів. Трипсинізовані еритроцити готували наступним чином.
Еритроцити, відмиті ЗФР, центрифугували при 1000 g протягом 5 хв. До 0,5 мл
осаду еритроцитів додавали 1,0 мл розчину трипсину (1 мг трипсину в 1 мл 0,15
М NaCl з 0,01 М NaHCO3, pH 7,8), перемішували і залишали в термостаті при +37о
С на 30-45 хв. Після цього еритроцити відмивали три рази 10-ти кратним об'ємом
розчину ЗФР і готували 2 % суспензію в ЗФР.
Обробку папаїном проводили аналогічно, лише з тією різницею, що замість
трипсину брали папаїн і додавали 0,5-1 мг L-цистеїну. Дещо триваліша інкубація
еритроцитів з трипсином та папаїном і вищі концентрації ферментів можуть
спричинити самогемаглютинацію. Отож під час постановки реакції з
протеолітичними ферментами потрібно здійснювати контроль (аглютинація
еритроцитів у відсутності лектинів). Трипсинізовані та папаїнізовані
еритроцити можна зберігати при +4о С протягом тижня.
Реакція преципітації нами використовувалась для дослідження взаємодії деяких
полісахаридів та глікопротеїнів з лектинами, а також для дослідження тих
лектинів, які не аглютинують еритроцити. Зокрема, лектин насіння гледичії
преципітує ристоміцину сульфат, але не аглютинує еритроцити. Реакцію
преципітації виконували наступним чином. У мікропробірку до 0,05 мл 1 %
розчину лектину додавали 0,05 мл 1 % або 3 % розчину ристоміцину сульфату, які
готували на забуференому фізіологічному розчині, рН 7,4 (ЗФР). Розчини
перемішували і залишали при кімнатній температурі на 30 хв, після чого
неозброєним оком або за допомогою лупи спостерігали утворення осаду або
помутніння розчину. Важливою передумовою спостереження реакції преципітації є
чистота початкових розчинів і відсутність у них осадів та мутності. Тому перед
проведенням реакції мутні розчини освітляли фільтруванням або
центрифугуванням.
2.2.2. В и я в л е н н я л е к т и н і в з а д о п о м о г о ю о с а д ж е н н
я м і к р о ч а с т о ч о к к о л о ї д н о г о з о л о т а, н а в а н т а ж е
н и х г л і к о п р о т е ї н а м и. Цей метод ми використовували для виявлення
та первинного аналізу лектинів, мічених колоїдним золотом, хоча, в принципі,
він може бути
- Київ+380960830922