РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Для дослідження ролі і механізмів модуляції і пластичності синаптичної передачі використовувалися нейрони інтактних гангліїв ЦНС двох молюсків, а також культура нейронів, виділених з головного мозку одного з представників ссавців (щура). Були застосовані наступні методичні підходи:
1) метод відведення внутрішньоклітинних потенціалів за допомогою мікроелектродів;
2) метод двоелектродної фіксації мембранного потенціалу;
метод фіксації мембранного потенціалу в конфігурації ціла клітина;
3) приготування первинної диссоційованої культури нейронів гіпокампа та культури нейронів некортекса;
4) іонофоретична аплікація;
5) аплікація під тиском.
Статистична обробка отриманих результатів проводилася за допомогою стандартних методів аналізу.
2.1. Методи дослідження синаптичної передачі в препаратах ЦНС аплізії.
Для вивчення синаптичної пластичності, яка лежить в основі модифікацій поведінки тварини, ЦНС безхребетних представляє унікальну можливість: не тільки досліджувати синаптичні зв'язки нейронів з однорідної популяції клітин (так званого кластера нейронів), але і вивчати синаптичні зв'язки індивідуально ідентифікованих нейронів. Ця можливість була використана нами в першій частині роботи, виконаній на нейронах центральної нервової системи (ЦНС) безхребетних, а саме нейронах молюсків Аплізії (Aplysiya californica) і Helix pomatia (Helix Pomatia).
Нейрони ЦНС аплізії і Helix pomatia мають досить великі розміри, що дозволяє використовувати мікроелектроди для тривалої внутрішньоклітинної реєстрації. Багато клітин можна ідентифікувати, і таким чином, у будь-якій кількості препаратів можна досліджувати ідентичні нейрони. У нейропілі ЦНС молюсків синаптичні контакти на відростках нейронів розташовані досить близько до тіла клітини. Завдяки цьому синаптичні потенціали в сомі нейронів можна реєструвати з мінімальним згасанням, тобто, синапси в гангліях молюсків є доступними для електрофізіологічного дослідження. Особливо слід зазначити таку перевагу використання ЦНС молюсків, як можливість встановлювати функціональну роль ідентифікованих нейронів та їх синаптичних зв'язків у певних типах поведінки.
Для вивчення пластичності синаптичної передачі, що лежить в основі модифікацій поведінки тварини, як об'єкт нами було обрано морського брюхоногого молюска аплізію. Більшість експериментів на аплізії була проведена на абдомінальному ганглії, який у певній мірі функціонує як маленький мозок, що керує декількома поведінковими реакціями. Слід також зазначити, що саме в цьому ганглії було детально досліджено роль багатьох ідентифікованих нейронів в поведінці аплізії. Вищенаведені переваги роблять аплізію привабливим об'єктом для подальшого вивчення ролі модуляції синаптичної передачі в пластичності поведінки цього молюска.
Будова тіла аплізії
Дорослі особи аплізії мають типову будову молюска - мають голову, ногу, мантію і вісцеральний мішок. На голові знаходяться рот, два маленьких ока, а також передні і задні щупальця.
Рис. 2.1. Будова тіла Aplisia californica.
А. Вид збоку, що дозволяє розглянути голову, мантію, вісцеральний мішок і ногу. Показано локалізацію абдмінального та головних гангліїв нервової системи всередині тварини. Б. Вид з дорсальної сторони. Параподії відтягнуті, мантія частково оголена. Тут також намічена схема нервової системи, щоб показати відносне розташування різних гангліїв. Схема взята з роботи Кендела [8].
Центральна нервова система аплізії
ЦНС аплізії складається з чотирьох парних головних гангліїв - церебрального, буккального, плеврального і педального, які утворюють кільце навколо стравоходу, - і єдиного непарного абдомінального ганглія, розташованого під стравоходом (Рис.2.2).
Рис. 2.2. Загальна схема будови нервової системи Aplysia і її розташування щодо внутрішніх органів. гангліїв Схема взята з роботи Кендела [8].
Церебральний, букальний, і педальний ганглії однієї сторони зв'язані з однойменними гангліями іншої сторони за допомогою трактів, які називаються комісурами, а з іншими гангліями їх з'єднують тракти, які називаються конективами. Церебральні ганглії іннервують щупальця й очі, букальні - букальну мускулатуру і передню частину травного тракту, а педальні і плевральні - ногу і параподії. З плевральних гангліїв виходять плевроабдомінальні конективи, що йдуть в абдомінальний ганглій. Абдомінальний ганглій складається з п'яти гангліїв, що злилися. Вони лежать близько друг до друга і зв'язані комісурами. Цей ганглій іннервує мантію і вісцеральний мішок і керує основними вісцеральними функціями: кровообігом, диханням, виділенням і внутрішніми процесами розмноження. Кожен ганглій містить приблизно 2000 нейронів і велику кількість гліальних клітин. Ганглії мають дві області: клітинну (тіла) і волокнисту (аксони). Тіла нейронів утворять подобу кори на поверхні ганглія. Ця клітинна область не містить аксонів і синапсів. Кожен нейрон посилає свій аксон у центральну область - нейропіль. В основному нейропіль являє собою область синаптичних контактів між нейронами. Крім того нейропіль містить волокна, що перетинають його, але не утворюють синапсів. Крім центральних гангліїв існують також групи нейронів на периферії, частина цих нейронів є моторними клітинами. Таким чином, ефекторні органи іноді мають подвійну іннервацію. Нейрони аплізії, як правило, уніполярні, тобто від тіла клітини відходить тільки один аксон. Дендритні відростки звичайно беруть початок від проксимальної частини головного аксона. На тілі нейрона синапсів немає, всі вони локалізовані вздовж дендритів. Нейрони розрізняються за розмірами, формою та кольором соми, розмірами головних дендритних відгалуджень та розподілом на них синапсів.
Ідентифіковані нейрони аплізії. Абдомінальний ганглій
Для ідентифікації нейронів можна використовувати наступні критерії: локалізація, характер спонтанної активності, шлях еферентного аксона, тип спонтанних постсинаптичних потенціалів, синаптичну відповідь на стимуляцію н
- Київ+380960830922