Содержание
СОДЕРЖАНИЕ...........................................................2
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...................................................5
ВВЕДЕНИЕ............................................................8
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР........................................13
Г. I. УРИДИНФОСФОРИЛАЗА - ФЕРМЕНТ МЕТАБОЛИЗМА У РИДИНА.......... 13
1.1.1. Общие сведения об уридинфосфорилазе......................13
1.1.2. Участие уридинфосфорилазы в гомеостазе уридина...........14
1.1.3. Влияние ингибиторов уридинфосфорилаз на гомеостаз уридина 15
1.1.4. Уридинфосфоилазная активность различных тканей в норме и при патологии................................................. 17
1.2. Применение уридинфосфорилазы и её специфических ингибиторов в
МЕДИЦИНСКОЙ ПРАКТИКЕ............................................ 18
1.2.1. Ингибиторы уридинфосфорилазы как перспективные антимикробные и антипаразитические препараты...............................18
1.2.2. Участие уридинфосфорилазы в метаболизме 5-фторурацила. Ингибиторы уридинфосфорилазы как модуляторы активности 5-фторурацила.....................................................19
1.2.3. Экспрессия уридинфосфорилазы в опухолевых клетках. Чувствительность опухолей различного происхождения к ингибиторам уридинфосфорилазы............................................21
1.2.4. Уридинфосфорилаза в активации капецитабина...............24
1.2.5. Защитное действие уридина при ишемии нервной ткани и миокарда26
1.3. Ингибиторы фосфорилаз.......................................28
1.3.1. Общая классификация ингибиторов уридинфосфорилазы...... 28
1.3.2. Производные ациклонуклеозидов............................29
1.3.3. Производные бензилациклоуридинов.........................29
1.3.4. Ингибирующая активность структурных аналогов уридина.....32
1.3.5. Производные ангидроуридина...............................34
ГЛАВА 11. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.......................................36
П. 1. Материалы..................................................36
11.1.1. Биологические материалы.................................36
11.1.2. Химические материалы....................................36
и.2. Программное обеспечение.....................................37
11.3. Методы.....................................................38
11.3.1. Кристаллизация........................................ 38
11.3.1.1. Метод равновесного диализа..........................41
П.3.1.2. Метод диффузии паров растворителя....................42
И.3.1.3. Применение информационных технологий для поиска условий кристаллизации...........................................44
11.3.2. Рентгенодифракционный эксперимент.'.....................47
2
11.3.2.1. Методы рентгеновской съёмки кристаллов......................47
11.3.2.2. Использование синхротронного излучения в рентгеноструктурном анализе.....................................49
11.3.2.3. Регистрация дифрагированных интенсивностей рентгеновского излучения.......................................................51
11.3.2.4. Ограничения метода РСА, обусловленные радиационным разрушением биополимеров........................................52
11.3.2.5. Обработка рентгеиодифракционных данных......................53
11.3.2.6. Определение начального набора фаз структурных факторов.
Метод молекулярного замещения.........................................54
П.3.2.6.1. Метод молекулярного замещения..............................56
И.3.2.7. Методы уточнения структур....................................58
11.3.2.8. Оценка достоверности уточнённых структур....................60
П.3.2.8.1. Критерии достоверности структурных данных..................60
11.3.2.8.2. Стандартный кристаллографический Я-фактор (ЯСГуы).........61
11.3.2.8.3. Лггсс.....................................................61
П.3.2.8.4. РОМ........................................................62
II. 3.2.8.5. Распределение торсионных углов ф и ф на карте Рамачандрана 63
11.3.2.8.6. Длины валентных и ионных связей...........................65
И.3.2.8.7. Значение углов валентных связей............................66
П.3.2.8.8. Ограничения планарности....................................66
11.3.2.8.9. Хиральность...............................................67
II. 3.3. Компьютерное моделирование.....................................67
П.3.3.1. Метод классической молекулярной динамики.....................67
11.3.3.1.2. Температура в МД эксперименте.............................70
11.3.3.1.3. Выбор длины траектории....................................71
11.3.3.1.4. Протокол молекулярной динамики............................72
П.3.3.1.5. Ограничения метода классической молекулярной динамики .. 73
11.3.3.2. Виртуальный скрининг и конструирование новых лекарственных препаратов......................................................73
11.3.3.3. Молекулярный докинг.........................................74 ,
11.3.3.3.1. Методы подгонки формы.....................................75
Н.3.3.3.2. Метод постепенного конструирования.........................75
И.З.З.З.З. Генетический алгоритм......................................76
Н.3.3.3.4. Анализ решений докинга.....................................77
11.3.3.4. Виртуальный скрининг, основанный на поиске фармакофоров.. 78
ГЛАВА III. ЭКСПЕРИМЕНТ И РАСЧЁТЫ............................................80
1П.1. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.............................................80
III. 1.1. Выделение и очистка препарата.................................80
III. 1.2. Кристаллизация................................................81
II 1.1.3. Получение экспериментального набора интенсивностей............83
Ш.2. Расчетная часть......................................................84
III. 2.1. Обработка рентгенодифракционных данных..................84
III.2.2. Решение и уточнение пространственных структур............86
III. 2.3. Докинг и компьютерное конструирование новых ингибиторов 90
III. 2.4. Исследование методом молекулярной динамики..............90
ГЛАВА IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ....................................95
IV. 1. Общее ОПИСАНИЕ структуры УРИДМНФОСФОРИЛЛЗ...................95
IV. 1.1. Кристаллическая упаковка молекул.........................95
IV 1.2. Пространственная организация молекул......................100
1У.2. Активный центр...............................................108
V Г. 2.1. Сайты связывания лигандов структуры БЮРИ с ионом фосфата и
2,2 -ангидроуридином.............................................109
1У.2.1.1. Фосфат-связывающий сайт..............................110
1У.2.1.2. Урацил-связывающий сайт..............................114
1У.2.1.3. Рибозо-связывающий сайт..............................115
IV.2.2. Предполагаемое влияние гидрофобных свойств молекулы
ингибитора на его связывание.....................................118
IV2.3. Роль петли Ь9 в связывании ингибитора......................119
ГУ.З. Детальное сравнение субъединиц различных структур комплексов ^гиРн............................................................121
IУ.4. ИО! I КАЛИЯ В СТРУКТУРЕ КОМПЛЕКСА УРИДИНФОСФОРИЛАЗЫ С ЛИГАНДАМИ
(2.2,-АПГИДРОУРИДИНОМ И ИОНОМ ФОСФАТА)............................ 127
IV.5. ИССЛЕДОВАНИЕ ЛАБИЛЬНОСТИ МОЛЕКУЛ £УСРН И У/ЦР1II МЕТОДОМ
МОЛЕКУЛЯР1ЮЙ ДИНАМИКИ............................................. 129
1У.6. ДОКИНГ 2,2'-ЛНГИДРОУРИДИНД В АКТИВНЫЙ ЦЕНТР УУиРн1.......... 133
IV.7. /УЖ/СОДИЗАЙН ВЫСОКОСЕЛЕКТИВНОГО ИНГИБИТОРА (ПОТЕНЦИАЛЬНОГО ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА)......................................... 136
IV. 7.1. Конструирование нового ингибитора уридинфосфорилазы класса 2,2'-ангидроуридина. замещённого в 5-м положенииурацильного колы{а 136
IV. 7.2. Конструирование нового ингибитора уридинфосфорилазы класса
2,2,-ангидроуридина замещённого в 6-м положении урацильного кольца. 140
1У.8. Заключение........................................141
1У.9. Перспективы.......................................144
ВЫВОДЫ..................................................145
БЛАГОДАРНОСТИ...........................................148
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................149
4
Список сокращений:
5FU, 5-ФУ, 5ФУ - 5-фтору рацил, C4H3FN20), 5-Фтор-2,4-(1Н,ЗН)-пиримидиндион
5-ДФУР, 5’dFUR- 5’-дезокси-5-фторуридин 5'ДФЦР - 5'-дсзокси-5-флуороцитидин AN EUR — 2.2’-ангидро-5-этилуридин ANU — 2.2’-ангидроуридин BAU - бензилациклоуридин В factor— температурный фактор
CCD, ПЗС - матрица полупроводниковых элементов с зарядовой связью
DTT — дитиотреитол
Е.С. (КФ) - код фермента
ÆcUPh - уридинфосфрилаза E.coli
F - структурный фактор
(Fcaicl— расчётная структурная амплитуда
|F0bs|— экспериментальная структурная ампли гуда
FdUMP - 5-фтор-2'-дезоксиуридин-5’-монофосфат
FdUTP - 5-фтордезоксиуридин-5'-трифосфат
FOM - Figures of merit
FUR - 5-фторуридин
FUTP - 5-фторуридин-5'-трифосфат
//UPhI - уридимфосфорилаза человека
I/sig(I) - отношение интенсивностей сигнал|шум
MAD — метод аномального рассеяния
NP - нуклеозидфосфорилазы
Р - функция Паттерсона
PDB - Protein Data Bank - банк белковых структур RCSBI PNP - пуриновая нуклеозидфосфорилаза PRPP - фосфорибозилдифосфат
5
РТАи - 5-фенилтио-ациклоуридин Я(П)- функция вращения
К.М.З.В. - среднеквадратичное отклонение (СКО) Кгасюг - стандартный кристаллографический фактор ЗА - метод моделированого отжига БПЗ - додецилсульфат натрия ЗЫ - реакция нуклеофильного замещения 5/иРЬ - уридинфосфорилаза ЕлурЫтипшп Т(у) - функция трансляции ига - урацил
АМФ(АМР) - аденозин-5*-монофосфат
АТФ - аденозила трифосфат
БПФ - быстрое преобразование Фурье
ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения
ГДФ - гуанозина ди фосфат
ГМФ (вМР) - гуанозин-5 ’-монофосфат
ГТФ - гуанозина трифосфат
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ДПФ - дискретное преобразование Фурье
ИЗ - метод тяжелоатомного изоморфного замещения
ИМФ - инозин-5'-монофосфат
ИПТГ - изопропил-1 -тио-Ь-О-тиогалактолиранозид
ЛДГ - лактатдегидрогеназа
МД - молекулярная динамика (метод)
МНК - метод наименьших квадратов НАД - никогинадениндинуклеотид НАДФ - никотинадениндинуклеотида фосфат ОМФ - оротидин-5-монофосфат ПЭГ - полиэтилен гликоль
РНК - рибонуклеиновая кислота РСА - рентгеноструктурный анализ СИ - синхротронное излучение Г МП — тимидин-5 ’-монофосфат УДФ - уридина ди фосфат УМФ(иМР) - уридин-5’-монофосфат УТФ - уридина триифосфат У Фаза, ЦРЬ - уридинфосфорилаза ФАД(РАО) - флавинадениндинуклеотид ФАЛА - М-(фосфонацетил)-Ь-аспартат ФМН(РМЫ) - флавинмононуклеотид ЦЦФ - цитидина дифосфат ЦМФ - цитидин-5’-монофосфат
ЭДТА - динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты
Трёхбуквенные обозначения аминокислотных остатков являются общепринятыми и утверждены ШРАК (Международный союз теоретической и прикладной химии).
7
Введение.
Множество лекарственных препаратов, используемых в настоящее время, взаимодействует с белками-ферментами. Это относится как к непосредственному механизму действия препарата (фармакокинетика), так и к превращению и разрушению лекарственных средств в организме и в очаге патологического процесса (фармакодинамика). Модулируя активность белков-ферментов, можно повысить эффективность лечения и снизить побочные эффекты. Одним из таких интересных с фармакологической точки зрения, белков является уридинфосфорилаза.
Уридинфосфорилаза (УФаза; UPh; Е.С. 2.4.2.3) с участием иона фосфата катализирует реакцию превращения уридина в урацил [1]. Фермент участвует в ре-синтезе пиримидиновых оснований. Уридинфосфорилаза как объект исследования представляет интерес для многих областей медицины. Этот фермент играет решающую роль в так называемом быстром клиренсе, то есть выведении из организма избытков плазменного уридина. Внутривенное введение частично очищенной бактериальной уридинфосфорилазы приводит к быстрому фосфоролизу уридина плазмы и ннгибированию активности «реутилизационного» пути на 65-92% [2].
В организме человека уридинфосфорилаза принимает участие в метаболизме противоопухолевых препаратов - антиметаболитов пиримидинов, которые, несмотря на высокую токсичность, остаются основным средством химиотерапии некоторых видов опухолей, например, плоскоклеточного рака прямой кишки [3]. Противоопухолевый препарат 5-фторурацил (5ФУ) является антиметаболитом урацила из-за конкуренции за тимидилатсинтетазу. В результате действия 5ФУ нарушается синтез нуклеиновых кислот и достигается остановка пролиферации и/или гибель опухолевых клеток. 5ФУ - важнейший компонент современной химиотерапии - успешно применяется при раке толстой кишки, молочной железы, органов пищеварения, мочеполовой системы, а также при опухолях кожи. M.Iigo и соавт. [4J показали, что
8
ингибиторы уридинфосфорштазы способствуют увеличению активности 5ФУ при химиотерапии индуцированного рака молочной железы у мышей линии BDFi и трансплантатов плоскоклеточного рака толстой кишки человека у безтимусных мышей. В опытах на мышах линии CDgF* установлено, что введение ингибитора уридинфосфорилазы - бензилациклоуридииа (BAU) (240 мг/кг) позволило уменьшить дозу 5ФУ в 1.5 раза при гой же терапевтической эффективности [5]. Тем самым показана возможность изменения активности 5ФУ специфическими ингибиторами уридинфосфорилазы с целью снижения токсичности основного препарата.
Перспективным является применение ингибиторов уридинфосфорилаз не только для борьбы с онкологическими заболеваниями, но и с некоторыми инфекционными, вызванными бактериями и простейшими, так как ре-синтез уридина, протекающий преимущественно с участием уридинфосфорилазы и урацилфосфорибозилтрансферазы, чрезвычайно важен для жизнедеятельности микроорганизмов. Роль УФазы в обмене уридина у высших организмов менее значима, чем для микроорганизмов, так как большая часть пиримидиновых оснований в клетках высших организмов синтезируется де ново, и только значительно меныиая синтезируется путем ресинтеза [6]. Клетки же многих микроорганизмов лишены тимидинфосфоралазной активности, и именно уридинфосфорилаза катализирует в них фосфоролиз как рибо-, так и дезоксирибопиримидин нуклеозидов. Инактивация фермента-хозяина не будет столь существенна для высших организмов в целом, как инактивация единственного фермента для паразита. Ингибирование УФазы, как показати опыты in vivo, летально для некоторых паразитов (например, Giardia lamblia, Schistosoma mansoni), являющихся возбудителями заболеваний человека [7-9]. Основой создания новых антипаразитических препаратов и антибиотиков могут быть структуры атомного разрешения комплексов ферментов-мишеней прокариот и высших организмов с низкомолскулярными химическими соединениями (лекарство).
9
Однако нерациональное применение ингибиторов фосфорилаз, особенно с недостаточно высокой тканеспецифичностью, может вызвать осложнения. Исследования на смешанной культуре клеток астроцитов с нейронами и на релерфузированном мозге показали, что уридин защищает клетки от гибели. Степень повреждения клеток в этих опытах контролировали как морфологически, так и по активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) - маркера клеточного повреждения при ишемии. Кроме того, этой группой исследователей показано, что в протекторном (защитном) действии уридина принимает участие уридиифосфорилаза нейронов гг астроцитов. Для выяснения роли уридинфосфорилазы в защитном действии уридина было определено, насколько блокирование УФазы влияет на протекторный эффект уридина в ишемизированных нейронах [10]. Таким образом, ингибирование уридинфосфорилазы в клетках мозга (нейронах и клетках астроцитарной нейроглии) и кардиомиоцитах может ухудшить состояние тканей при ишемии. Однако, по-видимому, существует способ снижения негативных последствий приема ингибиторов уридинфосфорилаз путем конструирования ингибиторов, не способных проникать через гистогематические барьеры, в частности, гемато-энцефалический барьер.
Коиш М.Н. с соавторами показал, что соединения класса 2,2’-аигидроуридинов являются эффективными ингибиторами для большинства уридинфосфорилаз клеток бактерий и простейших [11,12]. В связи с этим, из широкого класса ингибиторов УФазы был выбран ингибитор - 2,2’-ангидроуридин.
Разработка новых лекарственных препаратов-ингибиторов ферментативной активности невозможна без понимания механизма ингибирования на атомно-молекулярном уровне. Под механизмом ингибирования мы понимаем структурно-функциональные особенности взаимодействия фермент-ингибитор, такие как структура сайтов связывания ингибитора, характер взаимодействий атомов ингибитора с атомами фермента,
10
структурно-функциональные изменения, происходящие при образовании комплекса фермент-ингибитор. Для этого необходимо детальное исследование пространственной организации макромолекулярных комплексов уридиифосфорилаз бактерий и высших организмов методами рентгеноструктурпого анализа при атомном разрешении и компьютерного моделирования. На основании результатов этих исследований можно предложить структурно-функциональный аспект механизма ингибирования данного белка-мишени, что, в свою очередь, позволяет конструировать химические соединения-ингибиторы, более комплиментарные сайгам связывания ферментов и, возможно, более эффективные в качестве лекарственного препарата.
Целью данной работы было изучение пространственной организации молекулы уридинфосфорилазы из Salmonella typhi murium (S/UPh) и уридинфосфорилазы человека (ÄUPhl) в комплексах с разными лигандами и установление структурной основы ингибирования этих уридиифосфорилаз 2,2’-ангидроуридином (ANU) методом рентгеноструктурного анализа. Компьютерное моделирование оптимальных ингибиторов (аналогов 2,2’-ангидроуридина) уридинфосфорилазы человека и бактерий.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
• определение атомных структур комплексов ÄUPh с 2,2’-ангидроуридином, ионом фосфата и калия методом рентгеноструктурного анализа биомакромолекул;
• решение структуры комплекса //UPhI с 2,2’-ангидроуридином методом молекулярного моделирования;
• анализ структур комплекса “фермент-ингибитор” для HUP hl и StUPh;
• молекулярно-динамическое исследование Л/UPhI и SVUPh;
11
компьютерное конструирование потенциальных ингибиторов уридинфосфорилаз.
12
Глава І. Литературный обзор
1.1. Уридинфосфорилаза - фермент метаболизма уридина
1.1.1. Общие сведения об уридинфосфорилазе
Уридинфосфорилаза (иРЬ, У Фаза) - ключевой фермент метаболизма пиримидина, катализирующий обратимое фосфорилирование уридина (рис.1) с образованием урацила и рибозо-1-фосфата [13, 14]. Фермент идентифицирован в прокариотах, дрожжах и высших организмах [15].
Рисунок 1. Уравнение реакции катализируемой уридинфосфорилазой.
Физиологическая активность уридинфосфорилазы присутствует у всех живых организмов, от бактерий до человека, хотя структура гена и пространственная структура белковой молекулы У Фазы варьируют в широком диапазоне [16-19]. Белок экспрессируется в различных клетках и тканях человека и животных. У человека и высших позвоночных субъединица уридинфосфорилазы состоит из 310 аминокислот [16, 19], и её четвертичная структура представляет собой тетрамер или димер, в то время как у бактерий фермент функционирует в форме гексамера [20] (рис. 2). Ген У Фазы человека локализован на 12-ом локусе 7-ой хромосомы (7Р12) и состоит из 9 экзонов и 8 интронов [21].
13
(а) (б)
Рисунок 2. Трёхмерная структура молекул уридинфосфорилаз. (а) бактериальная уридинфосфрилаза из Е.соїі (ЕсІІРЬ) [20]; (б) человеческая уридинфосфорилаза 1-го типа (//иРЫ) [16].
1.1.2. Участие уридинфосфорилазы в гомеостазе уридина
Уридин является важным предшественником в "реутилизационном" пути пиримидинов, то есть повторном их использовании [22-24]. В присутствии сахаров уридин может быть важным предшественником, как в метаболизме углеводов, так и в биосинтезе пуриновых нуклеотидов через фосфоролиз, в результате чего продуцируется рибозный компонент или включается в пентозофосфатный путь (см. далее).
Уридин плазмы крови является основным ресурсом для "реутилизационного" пути пиримидинов. В физиологических условиях концентрация уридина в плазме строго поддерживается на уровне 4-6 мкМ почти у всех организмов [21, 25, 26]. Нефизиологическая доза экзогенного уридина вплоть до 250 мг/кг может повысить концентрацию уридина в плазме до 1 мМ, но этот показатель снижается до величины менее 10 мкМ в течение 1 часа. Авторы [25] обнаружили, что более 90% уридина плазмы поступает в печень. Нспаренхиматозные клетки вначале преобразуют уридин в урацил; затем гепатоциты, обогащенные дигидроурацилдегидрогеназой, отвечают за
14
- Київ+380960830922