Оглавление
Введение 5
Глава 1. Неорганические пирофосфатазы (обзор литературы) 7
1.1 Каталитические свойства неорганических пирофосфатаз Е.соН и 5.8сг/е51ас. 7
1.1.1 Кинетические схемы гидролиза пирофосфага РРазами 7
1.1.2 Эффективность различных металлов для катализа 9
1.1.3 Субстратная специфичность 11
1.1.4 Ингибирование пирофосфатаз 13
1.2 Первичная структура. Эволюционный аспект. 16
1.3 Рентгеноструктурный анализ пирофосфатаз 20
1.3.1 Пространственная структура пирофосфатазы Е.соН 21
1.3.2 Рентгеноструктурные исследования каталитического механизма 26
1.4 Модели механизма гидролиза 32
Глава 2. Материалы и методы 36
2.1 Получение кристаллов комплексов РРазе с Са2"1 и СаРР1 36
2.2 Подготовка кристаллов к сбору диффракпионных данных 36
2.3 Сбор и обработка диффракционных данных 37
2.4 Решение и уточнение структур 39
Глава 3. Методика улучшения диффракционного качества кристаллов РРазы 41
Введение 41
3.1 Способы улучшения диффракционного качества белковых кристаллов (обзор литературы) 42
3.1.1 Перезамораживание макромолекуляриых кристаллов 42
3.1.2 Настаивание в растворах, содержащих стабилизирующие агенты 44
3.1.3 Дегидратация 46
3.2 Методика улучшения диффракционного качества кристаллов
РРазы (результаты экспериментов) 47
3.2.1 Перезамораживание с постоянной концентрацией компонентов криораствора 47
3.2.2 Перезамораживание с постепенным изменением концентрации всех компонентов криораствора 49
3.2.3 Перезамораживание с повышением концентрации одного из компонентов криораствора 51
3.2.4 Улучшение разрешения настаиванием кристаллов в стабилизиркющем растворе с концентрацией МаС1, близкой к насыщенной с последующим быстрым замораживанием 54
3.2.5 Исследование влияния концентрации ИаСМ на диффракционное качество кристаллов при комнатной температуре 55
3.2.6 Обсуждение результатов 56
Глава 4. Результаты рентгеноструктурного анализа Са-РРазы и СаРРГРРазы 61
4.1 Качество моделей 61
4.2 Структуры Са-РРазы и СаРРГРРазы 66
4.3 Активный центр Са-РРазы 68
4.4 Активный центр СаРРьРРазы 71 Глава 5. Обсуждение результатов рентгеноструктурнош анализа
Са-РРазы и СаРРьРРазы 77
5.1 Сравнение положений связывания ионов Са2' и Мд?+, молекул
пирофосфата и фосфат-ионов в ктивном центре. 77
5. 2. Ингибирование пирофосфатазы ионами Са2' 80
5.3 Мсханиз гидролиза РР1 РРазой Е.соИ 82
Основные результаты и выводы 91
Благодарности Список литературы Приложения
Введение
Фермент, гидролизующий пирофосфат (РРЦ до фосфата (РЦ был обнаружен в тканях млекопитающих в 1928 году [1], а позднее в других организмах и типах клеток [1]. Эти ферменты были названы «неорганическими пирофосфатазами» (РРазы). Широкая распространенность иирофосфатаз связана с их значительной ролью в метаболизме клетки. РР1 является побочным продуктом многих равновесных реакций, таких как синтез нуклеиновых кислот, белков, липидов и полисахаридов. В организме взрослого человека в результате этих реакций образуется несколько килограммов РР1 в день. Гидролиз РР1 пирофосфатазами смещает равновесие реакций в сторону синтеза указанных биологически активных соединений.
Хотя ферменты фосфорного обмена образуют один из наиболее обширных классов в природе, механизм их действия недостаточно изучен. Центральная роль РРаз в метаболизме, сравнительная простота пирофосфата как субстрата, делают их привлекательными объектами для изучения. Информация, полученная при исследовании этих ферментов, может быть использована и для понимания механизма действия других ферментов, катализирующих похожие реакции гидролиза неорганических полифосфатов или органических полифосфатов, например АТФ. К настоящему времени пирофосфатазы являются наиболее хорошо изученными белками этой группы.
Для каталитической активности РРазе необходимо присутствие ионов двухвалентных металлов таких как М§2", Мп2+, 2п2* и ли Со2+ [2,3].
Ионы Са2+ являются сильным ингибитором гидролиза. Характер инактивирующего эффекта кальция является общим для всех известных пирофосфатаз. Ингибирование пирофосфатаз ионами кальция наступает при концентрации порядка 10'5 М, что соответствует пиковому уровню Са2+ в клетке [4]. Регуляция активности пирофосфатаз ионами Са2+ служит средством контроля концентрации пирофосфата.
5
Данная работа посвящена рентгеноструктурному исследованию двух комплексов неорганической пирофосфатазы E.coli: с ионами Са2+ и, с ионами Са2' и кальций-пирофосфатом (CaPPi) при атомном разрешении. Анализ этих структур впервые позволил определить способ связывания пирофосфата и ингибирующих металлов.
ß рамках этого исследования были решены следующие задачи: (1) получены кристаллы комплексов фермента; (2) разработана новая методика улучшения дифракционного качества кристаллов РРазы E.coli; (3) собраны наборы дифракционных данных для комплексов фермента с Са2' и CaPPi до атомного разрешения; (4) проведено уточнение структур; (5) проведен анализ полученных структур и их сравнение со структурами других комплексов неорганических пирофосфатаз E.coli и S.cervesiae со специфическими лигандами (ионами металлов-активаторов и продуктами гидролиза), а также апофермента E.coli; (6) обсуждены причины ингибирующего эффекта ионов Са2+ и механизм гидролиза субстрата на основе структурных данных.
6
Г лава Г.Неорганические пирофосфатазы (обзор литературы)
1.1 Каталитические свойства неорганических пирофосфатаз S. cerevisiae и E. coli
1.1.1 Кинетические схемы гидролиза пирофосфата неорганическими пирофосфа газами
Была исследована кинетика гидролиза пирофосфата неорганической пирофосфатазы из E. coli. Была предложена следующая схема гидролиза и синтеза пирофосфата, и расчитаны все константы скоростей промежуточных стадий и параметры равновесных процессов [5,6]:
к, . к3 к5 к7
EMg2 + Mg2PPc=^ EMg4PPi EMg2(MgPi>2^=^ EMg2MgPi-— BMg2 + MgP
Km2 EMg Km,
Kmi
К
Кпь
EMg3PPi EMg(MgPi)2 PPi MgPPi Mg2PPi ; Pi
Km5 EMgMgPi
MgPi
Рис 1. Кинетическая схема катализа РРазой из Е. соИ [6]. ЕГ^^ - комплекс фермента с ионами ЕМ&,РР1 - комплекс фермента с ионами и пирофосфатом, EMgnPin -комплекс фермента с ионами Mg и фосфатом. кп - константы скоростей элементарных стадий реакции. п=1-8 Ктп- константы Михаэлиса. п=1-5
Для каталитической активности фермента необходимо присутствие четырех ионов металла. Два из них связываются с пирофосфатазой до присоединения субстрата в центрах с высоким (М1) и низким (М2) сродством, третий (М3) и четвертый (М4) - одновременно с субстратом. В качестве активного субстрата авторы работы [6] рассматривают комплекс пирофосфата с двумя ионами магния (Mg2PPi), т.к. при исследуемых pH (7-9) и
7
концентрации свободных ионов металла (20 мМ) данная форма является преобладающей. Фермент-субстратный комплекс содержит четыре иона металла и молекулу пирофосфата (ЕМ^РР1). Комплексы, содержащие три иона металла (ЕМ£зРР1>, в данной системе также образуются, но они неактивны.
Лимитирующей стадией гидролиза пирофосфата является расщепление субстрата (кз) и освобождение двух молекул фосфата из активного центра фермента (к$,к7)>* Связывание субстрата - быстрый процесс, и становится лимитирующей стадией только при концентрациях РР1 ниже 0,2 мкМ. В обратной реакции синтеза скорость процесса определяет освобождение пирофосфата.
Для пирофосфатазы из 5. сеге^'юе была предложена кинетическая схема гидролиза и синтеза пирофосфага, в которой возможно участие как трех, так и четырех ионов металла [7]. В работе были также определены все константы скоростей элементарных стадий и параметры равновесных процессов.
Рис. 2. Кинетическая схема гидролиза РРазы & сегеуіяіае. [7]. М - металл, Е - фермент, РР - пирофосфат, Р - фосфат. Кт„- константы Михаэлиса. п=1-6. кп, к"п- константы скоростей элементарных стадий реакции.п=1-4
Все фермент- субстратные комплексы включают два или три иона магния. Сродство фермента к ионам металла заметно увеличивается в присутствии субстрата [8,9]. Обе формы пирофосфата - М£РРі и М&РРі могул быть активными субстратами,
МЕ=^Е
^тп1
- Київ+380960830922