Оглавление
Принятые сокращения........................................................6
Введение...................................................................7
Глава 1. — Решение многонарамегрической обратной задачи нелинейной флуориметрии молекулярных систем с высокой локальной концентрацией флуорофоров (на примере молекул хлорофилла а в фотосинтезирующих организмах)........................................................14
1.1. Введение.............................................................14
1.2. Нелинейная лазерная флуориметрия молекул хлорофилла а в фотосинтезирующих организмах (по литературным данным)..............................15
1.2.1. Модель формирования флуоресцентного отклика хлорофилла а
в фотосинтетическом аппарате на импульсное лазерное возбуждение......15
1.2.2. Метод нелинейной флуориметрии.................................23
1.2.3. Особенности нелинейной флуориметрии фотосинтезирующих организмов как представителей систем с высокой локальной концентрацией флуорофоров......................................................25
1.3. Теоретическое исследование прямой задачи нелинейной лазерной флуориметрии фотосинтезирующих организмов.....................................31
1.3.1. Анализ формирования кривых насыщения флуоресценции хлорофилла а в квазистациоларном и нестационарном режимах возбуждения.31
1.3.2. Исследование зависимости фотофизичсских параметров от характеристик лазерного возбуждения: границы применимости используемой модели.......................................................37
1.3.3. Влияние пространственно-временного распределения лазерных импульсов на кривые насыщения флуоресценции в квазистационар-
ном и нестационарном режимах возбуждения.............................42
2
г
1.4. Двухэтапный алгоритм решения многопараметрической обратной задачи нелинейной лазерной флуоримстрии............................................44
1.4.1. Вариант I: квазистационарный режим возбуждения флуоресценции на обоих этапах. Исследование единственности и устойчивости решения обратной задачи к ошибкам входных данных...............................44
1.4.2. Вариант II: последовательное применение квазистационарного и нестационарного режимов возбуждения флуоресценции. Исследование единственности и устойчивости решения обратной задачи
к ошибкам входных данных...............................................50
1.4.3. Анализ источников ошибок в решении обратной задачи нелинейной флуориметрии по предложенному алгоритму.......................53
1.5. Экспериментальная реализация предложенных алгоритмов определения фотофизичсских параметров хлорофилла а из кривых насыщения флуоресценции .....................................................................55
1.5.1. Экспериментальная установка.....................................55
1.5.2. Методика измерения кривых насыщения флуоресценции...............60
1.5.3. Экспериментальная апробация лазерного спектрометра..............64
1.6. Обсуждение результатов.................................................68
Глава 2. — Исследование механизмов нсфотохимического тушении возбужденных состояний хлорофилла а в фотосинтезирующих организмах...............70
2.1. Введение...............................................................70
2.2. Механизмы нефотохимического тушения (по литературным данным)...........71
2.2.1. Каналы дезактивации возбужденных состояний молекул хлорофилла а в фотосинтетическом аппарате.................................71
2.2.2. Тушение возбужденных состояний хлорофилла а при светоиндуци-ровашюм превращении вспомогательных пигментов фотосинтетическо-
го аппарата (зеаксантин-зависимое тушение).............................76
3
2.2.3. «Классические» флуоресцентные методы исследования фотосинтезирующих организмов: метод индукции и релаксации флуоресценции........78
2.3. Исследование механизмов зеаксантин-зависимого тушения на выделенных препаратах фотосинтетичсского аппарата.................................81
2.3.1. Материалы исследования: препараты светособирающих комплексов фотосистемы 2................................................81
2.3.2. Зависимость времени жизни возбужденных состояний хлорофилла а и скорости их синглет-синглетной аннигиляции от значения pH буферной среды...................................................82
2.4. Изучение механизмов нефотохимического тушения в нативных клетках микроводоросли Chlorella pyrenoidosa.......................................85
2.4.1. Протокол исследования нефотохимического тушения в нативных клетках Chlorella pyrenoidosa....................................85
2.4.2. Определение кинетики нарастания и затухания нефотохимического тушения с использованием метода индукции и релаксации флуоресценции..............................................................87
2.4.3. Связь значений фотофизических параметров хлорофилла а с эффективностью зеаксантин-зависимого нефотохимического тушения.....88
2.5. Обсуждение результатов................................................92
Глава 3. — Изучение влияния факторов среды на фотофизические параметры хлорофилла а в микроводорослях.......................................95
3.1. Введение..............................................................95
3.2. Влияние факторов среды на функциональное состояние фотосинтетиче-ского аппарата (по литературным данным)....................................96
3.2.1. Влияние условий роста фотосинтезирующих организмов на фото-синтстический аппарат и эффективность фотофизических процессов в нем 96
4
2+
3.2.2. Токсичность ионов тяжелых металлов (на примере Си“ ) в клетках фотосинтезирующих организмов..........................................97
3.3. Экспериментальное изучение влияния естественных факторов среды на фотофизические параметры хлорофилла а в фотосинтетическом аппарате.........99
3.4. Исследование возможности использования фотосинтезирующих организмов в качестве биоиндикаторов присутствия в среде тяжелых металлов........104
3.5. Обсуждение результатов...............................................108
Заключение................................................................109
Литера гура...............................................................111
5
Принятые сокращения
АЦГ1 — аналого-цифровой преобразователь ВП — вспомогательные пигменты Вио — виолаксантин Зса — зеаксантин
КР — комбинационное рассеяние света Лют — лютеин
НФТ — нефотохимическое тушение
ПДК — предельно допустимая концсшрация
РЦ — реакционный центр
СОС — сложное органическое соединение
ССЛ — светособирающая антенна
ССК II — светособирающие комплексы фотосистемы 2
ФС II — фотосистема 2
ФСО — фотосинтезирующие организмы
ФЭУ — фотоэлскфонный умножитель
Хл а — хлорофилл а
DCMU — 3-(3.4-dichlorophenyl)-l ,1-dimethylurea (гербицид диурон) FIRc — Fluorescence Induction and Relaxation
6
Введение
Флуоресценция молекул хлорофилла а (Хл а) — основного пигмента фотосинтезирующих организмов (ФСО) — является важным каналом получения информации о функциональном состоянии фотосинтетического аппарата и эффективности первичных процессов фотосинтеза, протекающих в нем [1].
Из всех методов флуоресцентной спектроскопии (флуориметрии) ФСО наиболее распространенными являются подходы, позволяющие измерять фотофизиче-ские параметры фотосинтетического аппарата как целого [2], то есть на уровне клеток .и клеточных органелл. В основе этих методов лежит зависимость квантового выхода флуоресценции молекул Хл а от эффективности остальных, конкурирующих с флуоресценцией процессов дезактивации их возбужденных состояний [3]. К заметным преимуществам подобных «классических» подходов- можно отнести однозначную биофизическую интерпретацию определяемых параметров и относительную простоту их технической реализации. Вместе с тем, эти методы не решают в полной мере задачу установления механизмов ряда фотофизических процессов в ФСО, таких, например, как фотоадаптация к избыточному освещению [4] и изменения в фотосинтетическом аппарате под воздействием факгоров окружающей среды [5]. Эти методы оказываются недостаточными и для флуоресцентной диагностики ФСО в режиме дистанционного зондирования [6] с характерным для этого режима дефицитом априорной информации об исследуемых объектах.
Возможности флуоресцентной диагностики существенно возрастают, если определение флуоресцентных параметров на клеточном уровне дополнено измерением параметров на молекулярном уровне [7] — параметров молекул Хл a in vivo. Наиболее перспективными из методов, позволяющих проводить подобные измерения, представляются методы, использующие для возбуждения флуоресценции импульсное лазерное излучение, в частности, развиваемый в диссертационной работе метод нелинейной лазерной флуориметрии [8].
Однако'К началу исследований по теме диссертации возможности этого метода были реализованы в ограниченном объеме: созданные ранее алгоритмы решения обратной задачи нелинейной лазерной флуориметрии ФСО, входными данными
7
для которой являются кривые насыщения флуоресценции, позволяли определять, с приемлемой точностью, лишь два параметра, представляющих собой свертки нескольких фотофизичсских параметров молекул Хл а [9]. Установленная высокая чувствительность этих параметров к видовой принадлежности микроводорослсй, составляющих фитопланктонное сообщество, и некоторым факторам среды [10], стала стимулом к исследованию путей увеличения числа раздельно определяемых фотофизических параметров до величины, принципиально ограниченной формой кривой насыщения флуоресценции. Это открыло бы новые возможности в исследовании механизмов фотофизических процессов в ФСО и использования их в качестве биоиндикаторов состояния среды. Такая задача и была поставлена в данной работе.
Светособирающие пигмент-бел ко вые комплексы ФСО являются представителями широкого класса систем с высокой локальной концентрацией содержащихся в них флуорофоров (локальная концентрация пигментов, в том числе Хл а, в светособирающих комплексах составляет п0 ~ 1019 см'3 [11]), что принципиальным образом^ характеризует кривые насыщения флуоресценции таких объектов и, как следствие, подходы к разработке алгоритмов решения обратной-задачи нелинейной лазерной флуориметрии. Это определяет актуальность темы диссертации в развитии новых методик лазерной флуоресцентной спектроскопии. Акгуальность темы диссертационной работы для лазерной биофотоники ФСО связана с отмеченными выше перспективами использоватш се результатов в исследовании фоюфизических процессов в ФСО на молекулярном уровне, а также в разработке новых подходов в создании флуоресцентных биоиндикаторов состояния среды на основе ФСО.
Целью диссертационной работы является дальнейшее развитие метода нелинейной лазерной флуориметрии ФСО как представителей класса систем с высокой локальной концентрацией флуорофоров и исследование новых возможностей применения его в изучении фотофизических процессов в ФСО. Для этого в диссертационной работе решаются следующие задачи:
Г. Путем математического моделирования исследовать возможность увеличения размерности обратной задачи нелинейной лазерной флуориметрии ФСО до величины, принципиально ограниченной формой кривой насыщения флуоресценции.
8
2. Создать лазерный спектрометр для экспериментальной реализации предложенных методических подходов к увеличению размерности обратной задачи нелинейной лазерной флуориметрии ФСО.
3. Исследовать возможности метода нелинейной лазерной флуориметрии в рамках разработанных подходов в изучении биофизических процессов в ФСО (на примере процессов фотоадаптации к избыточному освещению), в том числе, совместно с «классическими» флуоресцентными методиками.
4. С использованием метода нелинейной лазерной флуориметрии провести оценку чувствительности фотофизичееккх параметров молекул Хл а в водных ФСО к различным факторам среды.
Научная новизна диссертационной работы связана со следующими положениями:
1. Предложен двухэтапный алгоритм решения обратной задачи нелинейной лазерной флуориметрии применительно к системам с высокой локальной концентрацией флуорофоров, существенно повышающий ес размерность и позволяющий- определить из экспериментальных кривых насыщения полный набор фотофизических параметров флуорофоров; используемых в-принятой математической модели флуоресцентного отклика.
2. Создан лазерный спектрометр для нелинейной флуориметрии ФСО, позволяющий реализовать как нестационарный (длительность лазерных импульсов — 0,3 не), так и квазистационарный (длительность импульсов — 20 не) режимы возбуждения их флуоресценции.
3. Впервые из экспериментальных кривых насыщения флуоресценции пиг-мент-белковых комплексов микроводорослей определены четыре приоритетных фотофизических параметра-молекул Хл a in-vivo — сечение возбуждения, эффективное время жизни возбужденного состояния, квантовый выход флуоресценции и максимальная скорость синглет-синглетной аннигиляции — причем на одном приборе, в рамках единого алгоритма.
4. С использованием предложенных подходов нелинейной флуориметрии исследованы процессы фотоадаптации в ФСО; полученные результаты позволяют сделать выводы об эффективности различных фотопротекторных механизмов.
9
5. Экспериментально показана высокая чувствительность фотофизических параметров Хл а в водных ФСО к различным факторам среды — естественным (в частности, изменению солености и содержания азота в водной среде) и антропогенным (присутствию в среде тяжелых металлов).
Научная и практическая значимость диссертационной работы обусловлена возможным применением полученных в ней результатов для решения фундаментальных и прикладных задач лазерной флуоресцентной спектроскопии, биофизики фотосинтеза и экологии:
— в исследованиях объектов, относящихся к классу систем с высокой локальной концентрацией флуорофоров;
— для получение новой информации о первичных процессах фотосинтеза
* и процессах фотоадаптации в ФСО (в частности, о конформационных изменениях в светособирающих пигмент-белковых комплексах);
— при'Практической разрабо тке лазерных (в том числе, дистанционных) методов биоиндикации состояния водных экосистем с использованием ФСО в качестве флуоресцентного сенсора;
— при разработке систем мониторинга влияния глобального изменения климата на состояние водной экосистемы.
Положения, выносимые на защиту:
1. Метод нелинейной лазерной флуориметрии с использованием предложенных в работе алгоритмов позволяет определять из экспериментальной кривой насыщения флуоресценции комплексов с высокой локальной концентрацией флуорофоров четыре фотофизических параметра флуорофоров — сечение возбуждения, максимальную скорость синглет-синглетной аннигиляции, время дезактивации возбужденного состояния, учитывающее все каналы релаксации возбуждения за исключением синглет-синглетной аннигиляции, и квантовый выход флуоресценции.
2. Использование нестационарного режима возбуждения флуоресценции позволяет повысить точность решения обратной задачи нелинейной флуори-метрии на величину, эквивалентную снижению амплитуды шума в экспериментальных кривых на 3 сШ при измерении их в квазистационарном режиме.
- Киев+380960830922