РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Характеристика об'єкту дослідження
Об'єктом наших досліджень були зародки прісноводної риби в'юна Misgurnus fossilis L.
В'юн широко використовується при дослідженні ряду проблем сучасної біології розвитку, в тому числі в ембріологічних, біохімічних, цитологічних та інших дослідженнях [42, 80, 106, 123 [а100][а101][а102][а103]та ін.].
Відносно коротка тривалість періоду ембріогенезу в цього виду, легкість одержання статевих клітин і відсутність особливих труднощів в утриманні цих риб у лабораторії пояснюють його популярність [111[а104]].
В'юн Misgurnus fossilis відноситься до родини в'юнових Cobitidae, ряду коропоподібних Cypriniformes, надряду кісткових риб Teleostei.
У природних умовах в'юн нереститься в першій половині травня при температурі води 13-14оС [87[а105]].
Яйцеклітини в'юна за характером розподілу в них цитоплазми і жовтка відносяться до типу телолецитальних, а за співвідношенням цих компонентів - до поліплазматичних. Зріла яйцеклітина знаходиться на стадії метафази другого поділу дозрівання. Діаметр зрілого яйця (без оболонок) становить 1,17-1,30 мм [111[а106]]. Оболонка яйця складається з добре розвиненої zona radiata і зовнішньої оболонки ворсинчатої будови. Ворсинки маленькі, слабо виступають над поверхнею оболонки. У водному середовищі ворсинки набрякають і стають клійчастими, що сприяє прикріпленню яєць до субстрату [111[а107]]. Оболонка зрілого яйця в'юна, як і інших кісткових риб, має білкову природу, але між zona radiata і ворсинчатим шаром є тонка оболонка, що містить багато полісахаридів [137[а108]]. Білки, які входять до складу zona radiata, нерозчинні у воді та сольових розчинах, але розчиняються під дією трипсину [81[а109]].
Як і у всіх кісткових риб, в оболонці яйцеклітин в'юна є одне мікропіле, розташоване у ділянці анімального полюса яйцеклітини. Воно є лійкоподібним заглибленням поверхні оболонки, яке переходить у короткий кінцевий каналець. Каналець відкривається в цитоплазму на внутрішній поверхні zona radiata [41[а110]], причому діаметр кінцевого каналу відповідає ширині головки спермія в'юна.
Біля поверхні цитоплазми зрілого яйця знаходиться шар кортикальних альвеол. На анімальному полюсі, в районі мікропіле, розташоване ядро на стадії метафази ІІ [111[а111]]. Більша (центральна) частина яйцеклітини заповнена дейтоплазматичними включеннями (жовтком). Жовток накопичується в ооциті у вигляді жовткових гранул. У в'юна при дозріванні яйцеклітин жовткові гранули не зазнають помітних змін, вони не зливаються між собою, а зберігаються у вигляді окремих структур [41[а112]]. Окремі жовткові гранули в зрілій яйцеклітині мають діаметр 4,5-4,8 мкм [265[а113]]. Жирові крапельки у жовтку відсутні.
Запліднення у в'юна зовнішнє, моноспермне. У перші секунди після запліднення жовткова оболонка відділяється від поверхні яйця й утворюється перивітеліновий простір. Одночасно починається стягування цитоплазми до анімального полюса яйця й утворення цитоплазматичного горбика. У його утворенні приймає участь не вся цитоплазма. Тонкий шар цитоплазми оточує жовток, і, крім того, тонкі її тяжі пронизують жовток, анастомозують між собою і утворюють всередині жовтка тонку сітку [124[а114]]. Після відділення оболонки і утворення перивітелінового простору діаметр заплідненого яйця (разом з оболонками і перивітеліновим простором) дорівнює 1,69 мм [87[а115]], а діаметр власне яйця (без оболонки) - 1,1-1,3 мм. Висота бластодиска складає 0,35-0,45 мм.
Для проведення експерименту використовувались яйцеклітини і зародки в'юна Misgurnus fossilis L., які отримували за методикою Нейфаха [104[а116]]. У лабораторних умовах риб утримували в холодильнику при температурі +4-5оС. Для отримання ікри самкам внутрішньом'язово вводили 500 міжнародних одиниць хоріогонічного гонадотропіну. Овуляція наступала через 36 годин при температурі +19-20оС.
Зиготи починали інкубувати при температурі +20-22оС в розчині Гольтфретера. Стадії розвитку контролювали візуально під бінокулярним мікроскопом МБС-9.
Після однієї години інкубації зиготи при температурі 21,5оС з'являються перші два бластомери зародка, причому борозна першого поділу дроблення проходить меридіально. У подальшому вік зародків вимірювали або часом після запліднення, або номером поділів бластомерів, або числом ?о - умовних одиниць "Детлаф", що дістали назву на честь авторів, які їх запропонували [53[а117]]. Величина ?о - це тривалість одного мітотичного циклу в період синхронних дроблень 2-4 бластомерів, яка для в'юна при температурі 21,5оС складає 31 хв. Так, через 1,5 год після запліднення, або через 3 ?о, відбувається ІІ поділ: кількість бластомерів - 4. Борозна другого поділу теж меридіальна, але проходить перпендикулярно до борозни першого дроблення. Через 2 год (4 ?о, ІІІ поділ) зародки мають 8 бластомерів, а через 2,5 год (5 ?о, ІV поділ) - 16, причому і ці борозни проходять меридіонально і перпендикулярно попереднім. Через 3 год (6 ?о, V поділ) зародки представлені 32 бластомерами, але борозна п'ятого поділу проходить паралельно екватору жовтка, в результаті чого на анімальному полюсі утворюється "шапочка", тобто бластодиск, клітини якого ще не відділені від жовтка мембранами. Після 3 год клітини нижнього шару торкаються жовтка безпосередньо своєю базальною частиною, а верхні оточені з усіх боків плазматичними мембранами. Вперше з'являються якісні відмінності між бластомерами [42[а118]]. На наступній стадії дроблення (7 ?о, VI поділ) зародок має 64 бластомери, які розташовані 2-3 шарами і утворюють "високу шапочку". Через 4 год після запліднення (8 ?о, VII поділ) зародки мають 128 бластомерів, через 5 год (10 ?о, IX поділ) - 512 бластомерів, що утворюють морулу. Після цієї стадії поділу відбувається десинхронізація каріокінезу в різних клітинах, а на стадії 12 ?о (XI поділ) формується рання бластула - "шапочка" бластомерів здіймається над жовтком, зовнішні бластомери утворюють епібласт. На цій стадії починається асин