РАЗДЕЛ 2
Объекты и методы исследований
2.1. Объекты исследования
Объектами исследования служили пять прокариотических штаммов культур микроорганизмов: Bacillus megaterium ATCC 14581, Bacillus subtilis ATCC 6051, Bacillus fusiformis ATCC 7055, Paracoccus denitrificans ATCC 13543 и Micrococcus luteus ATCC 4698 .
Чистота культур поддерживалась и проверялась высевом на твердые агаризованные питательные среды в чашках Петри.
Образцы нитрифицирующей и денитрифицирующей биопленок были взяты из стационарных лабораторных реакторов, используемых для биологической очистки модельной сточной воды, загрязненной аммонием и нитратом.
Подземная вода с повышенным содержанием нитратов.
2.2. Питательные среды и режимы культивирования
Бактерии B. megaterium, B. subtilis, B. fusiformis, P. denitrificans и M.luteus культивировали на среде, содержащей, г/дм3: дрожжевой экстракт (DIFCO Laboratories, USA) - 2.5 г ; триптон (DIFCO Laboratories, USA) - 1.0 г; глюкоза - 1.0 г; деионизированная вода до 1 дм3; рН среды 7.2 . Выращивание микробных популяций проводили в колбах (350 см3), помещенных на качалку - термостат (150 об/мин) с объемом бактериальной суспензии - 100 см3, при температуре культивирования - 28?2?С.
В работе использовали минеральную среду, моделирующую подземную воду, (с повышенным содержанием нитратов, аммония, фосфатов и сульфатов) состава, мг/дм3 водопроводной воды: KNO3, 40; глицерин, 20; (NH4)2SO4, 15; К2НРО4 ? 3Н2О, 8; КН2РО4, 2; MgSO4 ? 7H2O, 5; CaCI2, 10. Глицерин был выбран как источник углерода для денитрифицирующих бактерий, потому что он - не токсичное вещество и не нуждается в особых способах транспортировки и хранения.
2.3. Установка для водоочистки
Биологическую очистку модельной воды, загрязненную аммонием и нитратом, осуществляли на установке, состоящей из одного анаэробного денитрифицирующего и двух аэробных нитрифицирующих биореакторов (рис.2.1).
Рис.2.1 Нитрифицирующая-денитрифицирующая экспериментальная установка.
2.4. Характеристика носителей
Исследовали следующие образцы носителей: (а) BC-Ring? в виде нити с переплетенными петлями волокна, этот носитель далее называли условно "волокно"; (б) Bio-S?, поливинилхлоридная (ПВХ) сеть, далее "сеть"; (в) поливинилхлоридный (ПВХ) пластинчатый контактный элемент, состоящий из комбинации рифленых пластин, "пластины"; (г) 3-мм кубики из пенополистерола, "кубики".
Физическими методами измерения определяли основные характеристики носителей: плотность носителя (г/см3), как отношение массы к объему носителя; удельную поверхность по отношению к грамму носителя (см2/г носителя), как отношение поверхности к массе носителя; удельную поверхность по отношению к объему носителя (см2/см3 носителя), как произведение удельной поверхности отнесенной к грамму на плотность носителя.
2.5. Характеристика геля
Для приготовления геля использовали альгинат натрия, представляющий собой полимер, состоящий из остатков D - маннуроновой и L - глюкуроновой кислот (рис.2.2), имеющий рН 6.0 - 7.5 .
Рис.2.2 Химическая структура молекулы альгината натрия.
В работе использовали 1 или 4 % раствор альгината натрия (SIGMA, USA) высокой вязкости. Раствор приготавливали следующим образом: 1 или 4 г (в зависимости от концентрации) альгината натрия замачивали в 20 см3 деионизированой воды и затем порциями добавляли в 80 см3 горячей деионизированой воды при постоянном перемешивании до образования однородного раствора. Полученные растворы альгината натрия охлаждали и в дальнейшем использовали для иммобилизации клеток микроорганизмов.
2.6. Режимы иммобилизации клеток денитрифицирующих бактерий
в альгинатном растворе
Для искусственного формирования биопленки на поверхности носителя использовали иммобилизованные клетки P. denitrificans в геле альгината натрия. Пятьдесят см3 культуральной суспензии центрифугировали при 700?g в течение 15 минут на высокоскоростной охлаждающей центрифуге, SUPRA 21К (Hanil Sceince Industrial Co., Korea). Полученный осадок суспендировали в 5 см3 стерильной воды. Концентрация биомассы составляла 32.4 мг сухой биомассы/см3. 1.5 см3 концентрата микробной суспензии смешивали с 25 см3 1% стерильного раствора альгината натрия (Sigma-Aldrich Co., USA). "Сеть" (3.5г) помещали три раза в смесь и затем на 2 часа в 2% раствор CaCl2. Толщина слоя геля с иммобилизованными клетками составляла от 25 до 250 мкм. "Сеть" с закрепленной биопленкой из геля была отмыта от раствора CaCl2 в модельной среде и использована в экспериментах по денитрификации. Концентрация бактериальной биомассы в альгинатном геле составляла 0.6 мг сухой биомассы/г геля.
2.7. Режимы формирование биопленок
Процесс формирования биопленки путем спонтанной адсорбции клеток денитрифицирующих бактерий на поверхности носителя состоял из ряда этапов:
- денитрифицирующие бактерии P. denitrificans выращивали в течение 2 суток на минеральной среде;
- стерильный носитель помещали в полученную культуральную жидкость и инкубировали совместно в течение 12 часов при 28?2?С на качалке - термостате (100 об/мин);
- отмывку носителя от остатков культуральной жидкости проводили
стерильной деионизированной водой в течение 2 часов при постоянном перемешивании;
- носитель с иммобилизованными клетками помещали в свежую питательную среду и инкубировали в течение 7 суток.
Формирование биопленки из препарата иммобилизованных клеток в вязком растворе альгината натрия проходил следующим образом:
- предварительно взвешенные образцы носителя помещали в 1 % или 4 % раствор альгината натрия с иммобилизованными клетками и тщательно перемешивали;
- избыток вязкого раствора удаляли;
- носитель со слоем альгинатного раст