Глава 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Экспериментальные исследования
2.1.1. Изучение токсичности и фармакокинетики антибиотика в комплексном применении с "Липином"
Для определения оптимального способа введения антибиотиков в организм: в свободной или липосомальной форме, в смеси с "Липином" или вслед за ним, контроля токсичности и эффективности вводимых препаратов нами были проведены экспериментальные исследования на базе Харьковского предприятия по производству иммунобиологических препаратов ЗАО "Биолек".
С целью определения токсичности антибиотиков аминогликозидной (4% раствор гентамицина сульфата) и цефалоспориновой (цефазолина натриевая соль) групп, в зависимости от способа их введения в организм и суточной дозы, в экспериментальных исследованиях использовали 488 белых беспородных мышей обоего пола, массой 18±0,5 г. Были выделены четыре группы:
* в первой группе антибиотик вводился в свободной форме;
* во второй группе антибиотик вводился в специально приготовленной липосомальной форме;
* в третьей группе антибиотик вводился в смеси с "Липином", приготовленным ex tempore;
* в четвертой группе антибиотик вводился через 10-15 минут после введения "Липина".
Исследования проводились для гентамицина при вариации суточной дозы от 20 мг до 1 мг препарата, и цефазолина - от 500 мг до 25 мг препарата. В таблицах 2.1.1.1. и 2.1.1.2. представлены данные о распределении лабораторных животных по группам в зависимости от суточной дозы вводимых антибактериальных препаратов.
Таблица 2.1.1.1.
Распределение животных по группам в зависимости от суточной дозы гентамицина
ГруппыФорма препаратаКоличество животныхСуточная доза гентамицина, мг20 мг10 мг5 мг4 мг3 мг2 мг1 мг1 группаСвободная5466101010662 группаЛипосомальная5466101010663 группаВ смеси ex tempore5466101010664 группаЧерез 10-15 минут после "Липина"62661010101010Всего22424244040402828
Таблица 2.1.1.2.
Распределение животных по группам в зависимости от суточной дозы цефазолина
ГруппыФорма препаратаКоличество животныхСуточная доза цефазолина (мг)500 мг450 мг300 мг200 мг100 мг50 мг25 мг1 группаСвободная661010101010882 группаЛипосомальная661010101010883 группаВ смеси ex tempore661010101010884 группаЧерез 10-15 минут после "Липина"66101010101088Всего26440404040403232
Приготовление препаратов: гентамицина сульфат (4%) фирмы "Здоровье" (г. Харьков), разводили 0,9% изотоническим раствором натрия хлорида таким образом, чтобы в 0,5 мл раствора содержалось от 20 мг до 1 мг антибиотика. Таким же образом разводили цефазолина натриевую соль фирмы "Киевмедпрепарат" (г. Киев). Липосомальные формы гентамицина и цефазолина готовились в лабораторных условиях по специальной методике, применяемой ЗАО "Биолек" для производства подобных лекарственных препаратов. Для приготовления необходимых доз смеси антибиотика с "Липином" (ex tempore), последний растворяли в 0,9% изотоническом растворе натрия хлорида содержащем необходимую дозу гентамицина или цефазолина. Полученную смесь встряхивали до образования однородного, гомогенного раствора молочного или светло-желтого цвета. Все препараты вводили в хвостовую вену животных в объеме 0,5 мл. За животными наблюдали 10 дней.
Исследования по сравнению фармакокинетики антибиотика в свободной форме и после предварительного введения "Липина" проводились на 70 мышах, разделенных на 2 группы по 35 животных в каждой. В обеих группах забор крови для исследования проводился в 7 сроков после введения антибиотика: через 5 минут, 30 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа, 8 часов и 10 часов.
2.1.2. Моделирование острой деструктивной пневмонии
Исследование проведено на 108 молодых (3 - 6 месяцев) белых крысах линии WISTAR, обоего пола, массой 180-250 грамм. Из них у 90 крыс была моделирована острая деструктивная пневмония по разработанной нами методике ("Спосіб моделювання гострих гнійно-деструктивніх пневмоній" патент Украины № 49634А от 16.09.2002 г.), а остальные 18 крыс составили группу интактных животных. Все животные находились в условиях стандартного лабораторного содержания и рациона питания. При работе с лабораторными животными мы придерживались "Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях" (Страсбург, 18.03.1986г.) и приказа МОЗ УССР №32 от 22.02.1988г.
Животные были разделены на 6 групп по 18 крыс в каждой:
* первая группа была контрольной - после моделирования деструктивной пневмонии лечение не проводилось;
* вторая группа - проводилось лечение гентамицином (в суточной дозе 2 мг/кг);
* в третьей группе - применялась комбинация гентамицина (в суточной дозе 2 мг/кг) и цефазолина (в суточной дозе 10 мг/кг);
* в четвертой группе использовали смесь гентамицина (в суточной дозе 2 мг/кг) и "Липина" (в суточной дозе 10 мг/кг);
* в пятой группе совместно вводился гентамицин (в суточной дозе 2 мг/кг), цефазолин (в суточной дозе 10 мг/кг) и "Липин" (в суточной дозе 10 мг/кг);
* в шестой группе находились интактные животные.
Эксперимент проводился в течение 10 суток. Животных выводили из опыта на 3, 6 и 10 сутки по 6 крыс из каждой группы на каждый срок.
Методика моделирования острой деструктивной пневмонии
Острую деструктивную пневмонию у животных вызывали интратрахеальным введением взвеси суточной культуры S.aureus (штаммы АТСС 25923 белый и АТСС 209 Р желтый) и E.coli (штамм АТСС 25922), полученной путем смыва стерильным 0,9% физиологическим раствором с косого агара. Перед заражением животных выдерживали при температуре 0(С в течение 1 часа в условиях повышенной (до 95%) влажности. Под эфирным наркозом, при помощи интратрахеального катетера, вводили смесь возбудителей по 0,1 мл в дозе 5?109(КОЕ/мл. Расчет LD50 при данном способе инфицирования проводился по формуле И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева (1962).
При лечении применяли антибактериал