РОЗДІЛ 2
ЗАГАЛЬНА МЕТОДИКА ТА ОСНОВНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Дослідження проводились впродовж 1992-2002 років у Державному науково-дослідному контрольному інституті ветпрепаратів та кормових добавок й
господарствах Львівської області згідно схеми 2.1.
Схема 2.1
Схема проведення досліджень
2.1. Виділення та ідентифікація аеробних спороутворюючих мікроорганізмів із роду Bacillus
Виділення мікроорганізмів роду Bacillus із кишечнику здорових поросят
визначило наше дослідження по вивченню біологічних властивостей цих бактерій та їх ролі в профілактиці і лікуванні шлунково-кишкових захворювань.
Бактеріологічне дослідження здійснювали за багатоступеневою схемою, включаючи початкові посіви на середовища для виділення аеробів із наступним висівом на селективні поживні середовища. Ідентифікацію бактерій проводили
згідно методичних рекомендацій по виділенню і ідентифікації бактерій роду Bacillus з організму людини й тварини [198] та визначників бактерій Берджі [252, 253].
Із усіх свіжовиділених штамів визначали культуральні, морфологічні, тинкторіальні та біохімічні властивості.
З метою виділення спороутворюючих бактерій пробу із кишечнику здорових поросят вносили в пробірки з стерильним фізіологічним розчином і проводили посіви на агаризовані поживні середовища: МПА, середовище Громико, середовище Гаузе. Через 18-24 години інкубування в термостаті за температури 370С переглядали посіви, робили мазки, фарбували їх за Грамом та відбирали культури спороутворюючих бактерій для подальших досліджень.
Культуральні властивості штамів оцінювалися за характером росту на м'ясо-пептонному агарі, середовищі Громико, Гаузе № 2 [89], м'ясо-пептонному бульйоні, картопляному агарі. При вивченні морфологічних
властивостей готували мазки і фарбували за Грамом.
Для ідентифікації виділених спороутворюючих мікроорганізмів вивчали їх морфологію, рухливість, тинкторіальні властивості, розміщення спор в середині клітини, форму колоній (колір, консистенцію, краї); при посіві на рідке поживне середовище звертали увагу на характер росту (у вигляді плівки, осаду, прозорість або мутність середовища).
Рухливість мікроорганізмів визначали в препараті "висяча крапля"[254].
Утворення аміаку, індолу, сірководню визначали за допомогою індикаторних папірців, які ставили під корок пробірки з МПБ. Для визначення гідролізу сечовини (наявність уреази) проводили посів на середовище з сечовиною. Для визначення ацетилметилкарбінолу з глюкози до досліджуваних культур, які вирощені на середовищі Кларка протягом 5 днів за температури 370С, додавали 1 мл 10% водного розчину КОН. Для визначення редукції нітратів досліджуваної культури
вирощували протягом 3-5 днів на м'ясо-пептонному бульйоні з 0,2% КNО3, потім додавали реактив Грісса. Редукцію нітритів визначали після росту культури на бульйоні з нітратами протягом 24-72 год. Гідроліз крохмалю визначали на
картопляному агарі. Чашки Петрі з засіяним картопляним агаром через 24-48 год заливали розчином Люголя. Для визначення утворення каталази культури
досліджуваних мікроорганізмів висівали на МПА в чашки Петрі, інкубували протягом 18-24 год за температури 370С. Після чого культури заливали 10% Н2О2.
Утворення газу із нітратів в анаеробних умовах визначали на модифікованому середовищі Гібсона.
Для визначення розщеплення глюкози досліджувані культури висівали на пів-рідке середовище Омелянського з глюкозою.
Здатність утворювати ацетилметилкарбінол (проміжний продукт, який утворюється при розпаді глюкози) встановлювали за допомогою реакції Фогес - Проскауера.
Для встановлення патогенні властивості мікроорганізмів, визначали вірулентність, токсигенність, гемолітичну активність, фібринолітичні властивості, а також вивчали властивість до персистенції на білих мишах [255].
Для визначення вірулентності аеробних спороутворюючих мікроорганізмів, добові культури досліджуваних штамів вирощували на середовищі Гаузе № 2 .
Готували змив культури з агару на фізіологічному розчині з розрахунку 1 млрд мікробних клітин в 1 мл за оптичним стандартом мутності.
Білим мишам вагою 18-20 г вводили внутрішньочеревно по 500 млн мікробних клітин. Спостереження за тваринами проводили протягом 5 діб.
Для визначення токсикогенності досліджувані культури вирощували протягом 10 діб на м'ясо-пептонному бульйоні, а потім центрифугували зі швидкістю 5000 об/хв протягом 30 хвилин, після чого для контролю на стерильність з нього проводили посів на середовище Гаузе. Стерильний центрифугат вводили білим мишам вагою 18-20 г внутрішньочеревно по 0,5, 1,0, 1,5 мл. Кожну дозу дос-
ліджували на трьох мишах. Стан тварин враховували протягом 5 днів після введення центрифугату. Реєстрували кількість тварин, що захворіла чи загинула.
Гемолітичну активність визначали посівом на 5% кров'яний агар. Якщо бактеріальні культури були гемолітичними, то після росту на такому середовищі
навколо культури утворювалися зони посвітління.
З метою визначення фібринолітичних властивостей в стерильні пробірки вносили по 0,1 мл цитратної плазми, 0,4 мл фізіологічного розчину, 0,25 мл 18-20 годинної бульйонної культури досліджуваного штаму, 0,25 мл 0,25% розчину CaCl2. Пробірки струшували і ставили в термостат за температури 370С на 15-20 хвилин. Якщо в пробірці утворювався згусток (так само як і в контрольній, куди замість культури вносили поживне середовище), то досліджувана культура не
володіє фібринолітичними властивостями. Розрідження згустку через 2 години свідчило, що культура має фібринолізин.
Визначення ЛД50 ентеробактерій проводили методом Кербера [256].
З цією метою були взяті білі миші, яких розділили на 5 груп. Тваринам
вводили внутрішньочеревно суспензію різних доз мікроорганізмів у фізіологічному розчині. Протягом 10 днів після інфікування проводили підрахунок загиблих тварин у відповідних експериментальних групах. Потім за методом Літчфільда і Уілкоксона пі