Особливостi каріотипу подружнiх пар з репродуктивними розладами різного походження

<p>РОЗДІЛ 2<br /> ВИБІР ПРЕДМЕТУ, ОБ'ЄКТУ І МЕТОДІВ ДОСЛІДЖЕННЯ <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Предметом дослідження виступали метафазні та прометафазні хромосоми лімфоцитів периферійної крові у подружніх пар з порушенням репродуктивної функції та донорів статевих гамет. <br /> Матеріалом дослідження були лімфоцити периферійної крові подружніх пар з репродуктивними розладами різного походження, що внесені в реєстр неплідних шлюбів та самовліьних викиднів епідеміологічної системи генетичного моніторингу, які створені в рамках виконання Цільової комплексної програми генетичного моніторингу в Україні на 1999-2003 рр., а також потенційні донори статевих гамет та неплідні пари, які були направлені для цитогенетичного обстеження в Київський обласний центр охорони здоров'я матері та дитини.<br /> Проведення цитогенетичного аналізу базувалось на дослідженні каріотипу людини. Каріотип - це сукупність морфологічних особливостей повного хромосомного набору, типового для клітин представника даного біологічного виду [139-145]. <br /> Мета хромосомного аналізу в клінічній цитогенетиці полягає в оцінці каріотипу для виявлення можливих кількісних або структурних аномалій хромосом шляхом аналізу препаратів з хромосомами, зафіксованими в стадії метафази та прометафази. Важливе значення має правильний запис каріотипу - згідно з уніфікованою системою опису та символізації [143, 145].<br /> В медичнiй генетицi цитогенетика людини - вiдносно молодий роздiл, хромосоми людини вперше було описано тільки півстоліття тому (J. Tjio i A. Levan), дещо пізніше визначено кiлькiсний склад каріотипу [144].<br /> Подальшi розробки методiв вивчення хромосом полягали у вирішенні проблем їх точної ідентифікації. Вiдкриття в кiнцi 70-х років високочутливого методу отримання прометафазних хромосом з кількістю 850-1000 сегментiв доповнило методичну базу i дало можливiсть бачити мiкроструктурнi перебудови. Цитогенетичний метод вивчення прометафазних хромосом зробив дослiдження бiльш точним [146-148].<br /> Проведення цитогенетичного дослідження базується на отриманні клітинної популяції з високою мітотичною активністю. Існують прямі та непрямі методи отримання хромосом [141-152]. <br /> Непрямі методи пов'язані з попереднім культивуванням в поживному середовищі клітин, виділених з організму. <br /> До непрямих методів належить культивування лімфоцитів периферійної крові, що і було використано в даній роботі. Метод складався з наступних етапів: забір крові, культивування в поживному середовищі, обробка клітин культури розчином колцеміду, дія на клітини гіпотонічним розчином, фіксація, приготування препаратів хромосом безпосередньо.<br /> Матеріалом слугувала периферійна кров, взята стерильним шприцем у обстежуваних осіб. Для проведення культивування було використане наступне обладнання: ламінарний бокс, термостат, виставлений на температурі +37 0C, центрифуга для центрифужних пробірок на 1000 об./хв. ваги, вортекс.<br /> У роботі застосовані наступні реактиви: розчин гепарину, розведений 0,9 % розчином NaCl (1:10); культуральна суміш "Pbmax" з усіма компонентами для культивування виробництва "Gibco" (розливали в пробірки для культивування, зберігали при температурі -20 0C ); колцемід, розчин KCl (0,55 М), етиловий спирт; крижана оцтова кислота.<br /> Для приготування гіпотонічного розчину 0,565 мг 0,55 М KCl розчиняли в 100 мл дистильованої води. Фіксуючу суміш готували наступним чином: змішували 950 етиловий спирт з крижаною оцтовою кислотою у співвідношенні 3:1. Готували суміш безпосередньо перед фіксацією. <br /> Техніка методу полягала в тому, що до культуральної суміші "Pbmax" (попередньо її нагрівши до кімнатної температури) додавали по 0,5 мл крові. Культивування проводили в термостаті, при температурі +37 0С. На 70-й годині культивування додавали в кожну пробірку по 0,2 мл розчину колцеміду і витримувати півтори-дві години (кінцева концентрація 10 мкг/мл).<br /> Потім центрифугували пробірки протягом 6 хв, знімали надосадову рідину, збовтували осад за допомогою вортекса, додавали гіпотонічний розчин, попередньо підігрітий до температури +37 0C. Експозиція в гіпотонічному розчині при кімнатній температурі тривала 15 хв. Знову центрифугували пробірки 6 хв. Знову знімали надосадову рідину, збовтували осад за допомогою вортекса, доливали щойно приготовлену фіксуючу суміш (експозиція при кімнатній температурі - 10 хв.). Потім ще двічі центрифугували пробірки по 6 хв. зі зміною фіксуючої суміші до одержання прозорої надосадової рідини. Після цього знову центрифугували та знімали надосадову рідину, а осад розкапували на предметні скельця. Під час розкапування брали предметне скло пінцетом зі склянки з дистильованою водою і, не витираючи, капали на зволожене скло пастерівською піпеткою три-чотири краплі суміші по всій довжині скла.<br /> Скло підписували та сушили в термостаті протягом двох днів до моменту його фарбування.<br /> Вигляд метафазних хромосом, отриманих за допомогою вищевказаного методу, представлений на рис. 2.1.<br /> Препарати прометафазних хромосом отримували з лімфоцитів периферійної крові, блокуючи клітини на межі двох фаз клітинного циклу G1/S [149]. В роботі використовували ті ж матеріали, обладнання, посуд, реактиви та розчини, що й для отримання метафазних хромосом. Додатково користувалися наступними розчинами. Маточний розчин метотрексату (10-4 М метотрексат) готували наступним чином: розчиняли 5,0 мг в 100 мл стерильного 0,9 % розчину NaCl. Робочий розчин метотрексату (10-5 М метотрексат) розчиняли 1:9 в стерильному 0,9 % розчині NaCl. <br /> Маточний розчин 10-3М 5-бром-дезоксиуридину отримували розчинивши 3,0 мг 5-бром-дезоксиуридину в 10 мл 0,9 % розчину NaCl. <br /> Процедура культивування не відрізнялася від попередньої, але далі на 50-й годині культивування вводили 50 мкл робочого розчину метотрексату, через 17 <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Рис.2.1. Метафазні хромосом</p>