РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Епізоотичну ситуацію щодо заразних хвороб перепелів в різних країнах світу вивчали шляхом аналізу спеціальної літератури та даних мережі Інтернет.
В Україні враховували як дані звітності установ ветеринарної медицини, так і дані, одержані при виїздах на перепелині ферми різних форм власності Харківської, Сумської, Полтавської, Луганської, Донецької, Дніпропетровської, Одеської областей та АР Крим, в яких проводили епізоотологічне обстеження.
Експериментальна частина роботи виконувалась на перепелиних фермах, кафедрах мікробіології і вірусології Харківської державної зооветеринарної академії та вірусології, патанатомії і ветсанекспертизи Сумського НАУ. Окремі дослідження проводились в лабораторії вивчення хвороб птиці Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН та відділі культур клітин Сумської біологічної фабрики.
Вивчались клініко-епізоотологічні дані, результати розтину та відбирався патологічний матеріал для лабораторних досліджень. За відповідними загальноприйнятими методиками проводили вірусологічні, бактеріологічні, серологічні та інші дослідження.
Для культивування вірусів використовувались перепелині та курячі ембріони і культури клітин, а для контролю бактеріальної контамінації - відповідні поживні середовища.
Культуру клітин перепелиних фібробластів одержували за класичною та апробованою нами (модифікованою) методиками. Перепелині яйця для інкубації надходили з господарств Полтавської, Сумської та Луганської областей, а курячі яйця - Харківської і Сумської областей.
Для виготовлення культури клітин використовували ембріони курей 10-11-добової, а перепелів 7-11-добової інкубації.
За загальноприйнятою методикою у ембріонів видаляли голови, крила, лапки і кишечник. За модифікованою методикою у перепелиних ембріонів видаляли тільки голови. Після подрібнення тканини ембріонів піддавали ферментативному розщепленню 0,25%-вим розчином трипсину за 3-5 циклами по 15-20 хвилин. Одержану суспензію клітин центрифугували 20 хвилин при 1000 об/хв. Надосадову рідину зливали, а клітини ресуспендували у визначеному об'ємі живильного середовища, фільтрували і підраховували їх кількість у камері Горяєва, розводили живильним середовищем до необхідної концентрації. Посівна концентрація клітин при одержанні культури ФЕК коливалася від 500 до 700 тисяч клітин в 1 см3, для суспензії ФЕП -100-800 тисяч. Суспензію клітин розливали в культуральні ємності (флакони, матраси, бутлі, пробірки) і витримували у термостаті при температурі +37оС до одержання моношару клітин двома методами, а саме: ролерним при використанні флаконів і бутлів та стаціонарним - у матрасах, флаконах та пробірках.
Культури клітин вирощували на поживних середовищах Ігла і 199 (вітчизняного виробництва). Випробувані також середовища виробництва американської фірми Sigma Chemical Company, а саме: 199, RPMI-1640, МЕМ і DME. Культивування клітин здійснювали як на моносередовищах, так і їх суміші в різних пропорціях. До середовищ додавали 10-15% сироватки крові великої рогатої худоби, бензилпеніцилін по 100 ОД та стрептоміцин по 100 мкг на 1 см3. В підтримуюче середовище сироватку не додавали. Концентрація водневих іонів (рН) становила 7,0-7,2.
При одержанні субкультур моношар клітин знімали зі скла 0,02%-вим розчином версену і ресуспендували в новому ростовому живильному середовищі.
Щоразу проводили контроль стерильності всіх використаних компонентів, а саме: трипсину, поживних середовищ, сироватки крові, одержаної суспензії клітин, фізрозчину, вірусовміщуючого матеріалу і т. ін. Кожен компонент окремо в кількості 0,5 см2 висівали на м'ясопептонний бульйон (МПБ), м'ясопептонний агар (МПА), м'ясопептонний печінковий бульйон (МППБ) та агар Сабуро. Посіви витримували не менше 7 діб при такій температурі: для МПБ, МПА і МППБ - +36+37оС, для агару Сабуро - +20+22оС - 14 діб. Облік результатів проводили візуально. Якщо хоч в одному з середовищ виявляли ознаки росту мікроорганізмів, відповідний компонент та суспензію клітин вибраковували.
Ембріони і одержані культури клітин використовували для індикації вірусів хвороби Марека, ньюкаслської хвороби, хвороби Ауєскі, інфекційного бронхіту, хвороби Гамборо і міксоматозу кролів. Зокрема, визначалась їх чутливість до штаму Таганрог-2001 вірусу хвороби Марека (польовий ізолят, ІЕКВМ УААН), штаму FC 126 герпесвірусу індиків (виробничий штам, ІЕКВМ УААН), штаму La Sota вірусу ньюкаслської хвороби (виробничий штам, Сумська біофабрика), штаму В-82 вірусу міксоматозу кролів (виробничий штам, Сумська біофабрика), штаму 18"в" УНДІЕВ вірусу хвороби Ауєскі (виробничий штам, Сумська біофабрика), штаму Н 120 Масачусетс вірусу інфекційного бронхіту курей (виробничий штам, фірма LOHMANN, Німеччина), штаму D78 вірусу хвороби Гамборо (вакцинний штам, фірма LOHMANN, Німеччина).
Інфікування ембріонів здійснювали за загальноприйнятою методикою. Перед інфікуванням їх продивлялись на овоскопі для встановлення життєздатності ембріонів і місця їх знаходження та розташування повітряної камери. Відібрані ембріони інфікували на ХАО.
Заражені та контрольні ембріони овоскопували щодня. Ті, що загинули, після охолодження в холодильнику протягом 4 або більше годин розтинали і відбирали матеріал для вірусологічних досліджень.
При інфікуванні культур клітин з флаконів (матрасів) зливали ростове середовище, моношар клітин промивали розчином Хенкса і заражали досліджуваним матеріалом. Після 30-60-хвилинного контакту з клітинами вірус видаляли і вносили в культуральний посуд підтримуюче середовище. Інкубація інфікованих клітин здійснювалась у термостаті. В контрольних флаконах з культурою клітин змінювали тільки ростове середовище на підтримуюче. Температура культивування вірусів залежала від їх виду, а саме: +33оС для вірусу міксоматозу кролів і +37оС для інших вірусів.
Культури клітин після інфікування двічі на день продивлялись під мікроскопом. Визначали наявність, характер та дина
- Киев+380960830922