РОЗДІЛ 2
ДОСЛІДЖЕННЯ ХІМІЧНОГО СКЛАДУ ЛИСТЯ ТА ВИЧАВОК ВИНОГРАДУ КУЛЬТУРНОГО З
ВИДІЛЕННЯМ І ВСТАНОВЛЕННЯМ СТРУКТУРИ БІОЛОГІЧНО АКТИВНИХ СПОЛУК
2.1. Короткі відомості про прилади, методи і реактиви
Для хроматографування застосовували різні сорти паперу "Filtrak"
(F N l,3,7,14), а також пластинки "Silufol UV-254" і " Silufol UV-366"(Чехія)
та “Sorbfil”-ПТСХ-А-УФ.
Для досліджень використовували метод висхідної і нисхідної одномірної,
двомірної і багаторазової хроматографії на папері (ПХ) та хроматографії в
тонкому шарі (ТШХ). Результати значення Rf на хроматограмах є середніми
величинами 5-6 визначень.
Розчинники для приготування хроматографічних систем використовували
кваліфікації ч.д.а. або х.ч.; співвідношення розчинників, позначені цифрами,
взяті в об'ємних одиницях. Для хроматографування використовували наступні
системи розчинників.
№ 1 – н-бутанол-оцтова кислота-вода БОВ (4:1:2);
№ 2 - 2 % оцтова кислота;
№ 3 - 15 % оцтова кислота;
№ 4 – хлороформ (формамід 25 %);
№ 5 - хлороформ - оцтова кислота - вода (13:6:2);
№ 6 - етилацетат-оцтова кислота-мурашина кислота-вода (100:11:11:25);
№ 7 – етилацетат-мурашина кислота-вода (3:1:1);
№ 8 - ацетон-н-бутанол-вода (7:2:1);
№ 9 - 5 % оцтова кислота;
№ 10 - 1 % хлоридна кислота;
№ 11 - оцтова кислота-концентрована хлористоводнева кислота-вода (5:1:5);
№ 12 - гексан-ацетон (6:2);
№ 13 - гексан-ацетон (6:4);
№ 14 - гексан-ацетон (8:1);
№ 15 - хлороформ-метанол (9:1).
На хроматограмах речовини виявляли до і після обробки різними реактивами за
забарвленням у денному світлі та за флуоресценцією їх у фільтрованому
УФ-світлі:
А - 3% розчином хлориду заліза (ІІІ);
Б - діазореактивом;
В- парами аміаку;
Д - 10% спиртовим розчином гідроксиду натрію;
Е - анілінфталатним реактивом (0,33 г аніліну та 1,66 г кислоти фталевої в 100
мл н-бутанолу, насиченого водою);
Ж - 0,1% розчином нінгідрину в етанолі;
З - 10% розчином сірчаної кислоти;
К – 20 % розчином сірчаної кислоти;
Л - 1% спиртовим розчином хлориду алюмінію;
М - 5 % спиртовим розчином хлориду алюмінію;
Н – реактивом Бартона (рівні об’єми 0,1% розчинів хлориду окисного заліза (ІІІ)
і калія ферриціаніду);
П - 1% розчином ваніліну в концентрованій сірчаній кислоті;
Р - 10% розчином фосфорновольфрамової кислоти;
С – реактивом Шталя;
Т – розчином бромфенолового синього і метилового червоного (0,3 г
бромфенолового синього і 0,1 г метилового червоного розчиняли в 100 мл
метанолу).
Для хроматографічного розділення речовин, що досліджували, використовували
целюлозу (фракція 0,25-0,5 мм), силікагель марки КСК з розміром часток 0,25 мм,
марки LS 100/250 і порошок поліамідного сорбенту з розміром часток 0,25 мм.
Речовини аналізували після двох-, трикратної кристалізації з відповідних
розчинників і висушуванні у вакуумі при 10-2 мм рт. ст. над фосфорним
ангідридом протягом 4-х годин при 110°С.
Температуру плавлення визначали на блоці Кофлера.
УФ-спектри поглинання знімали на спектрофотометрах СФ-46 і "Speсord UV-Vis" у
кюветах з товщиною шару 10 мм при концентрації речовин 1-2.10-3 моль в
етанолі.
ІЧ-спектри знімали на спектрометрі UR-20 (Німеччина) в таблетках калію броміду
1 мм заввишки при співвідношенні речовини і наповнювача 1:200-1:400.
Оптичну активність глікозидів вимірювали на поляриметрі СПУ-Е.
Амінокислотний склад визначали на аналізаторі LKB 4151 "Альфа Плюс" (Швеція) на
колонці, заповненій іонообмінною смолою марки DCGA.
Жирнокислотний склад ліпофільного комплексу визначали на хроматографі
"Chrom-5".
Визначення елементного складу проводили на спектрометрі С-115М і приладі
ФПА-1.
Дослідження ліпофільного екстракту проводили за допомогою тривимірної скануючої
спектрофлуориметрії в УФ-світлі та видимому діапазонах спектру, використовуючи
спектрофлуориметр Hitachi F 4010.
Мікропрепарати для вивчення анатомічної будови листя винограду культурного
готували із свіжозібраної, фіксованої в суміші спирт - гліцерин - вода (1:1:1)
сировини; вивчали під мікроскопами МБР-1 і при збільшенні в 80, 200 і 400
разів. Діагностичні ознаки фотографували фотоапаратом “ФЕД-5” на плівку
"Мікрат-200".
2.2. Дослідження якісного складу біологічно активних речовин
листя та вичавок винограду культурного
Об’єктами наших досліджень були вичавки винограду культурного двох сортів
Каберне-Совіньйон та Ізабелла і листя винограду сорту Ізабелла. Вичавки
винограду сорту Каберне-Совіньйон були надані Інститутом винограду і вина
“Магарач” (м. Ялта). Листя винограду сорту Ізабелла були зібрані в Харківській
області в 2003-2004 роках. Вичавки винограду сорту Ізабелла, були отримані з
винограду даного сорту (після вичавлювання соку), також зібраного в Харківській
області.
Для встановлення якісного складу використовували загальноприйняті методи
досліджень – якісні реакції, ПХ, ТШХ.
Для приготування водних екстрактів 50,0 г сухої сировини, подрібненої до
розміру часток 2-3 мм, заливали 200 мл води і нагрівали зі зворотним
холодильником на киплячому водяному нагрівнику протягом 1 години. Отриману
витяжку фільтрували через складчастий фільтр. Екстракцію сировини проводили
двічі новими порціями розчинника. Обўєднаний екстракт концентрували у вакуумі
до 50 мл і використовували для визначення вуглеводів, амінокислот, дубильних
речовин, гідроксикоричних кислот.
Водно-спиртові екстракти отримували аналогічним чином. У якості екстрагента
використовували 50 % етиловий спирт. Водно-спиртову витяжку використовували для
визначення флавоноїдів, тритерпеноїдів [86,134].
Для проведення якісних реакцій на антоціани 10,0 г подрібнених вичавок
винограду обох сортів заливали 10 мл 1 % спиртового розчину хлоридної кислоти,
кип’ятили на киплячому
- Киев+380960830922