Розділ 2. Матеріали та методи досліджень
2.1 Виділення ізольованих клітин спинального , тригенімального гагліів та гіпокампу.
У дослідах використовувалися білі щури лініі Вістар WAG\GSto (Москва, Росія) віком 14-16 днів, що утримувались на стандартних лабораторних умовах у віварії Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України. Вибір тварин молодого віку пояснюється відносною легкістю формування гігаомних контактів між мікропіпеткою та мембраною гангліїв таких тварин, та спрощеним процесом декапітації щура. Після препарування ганглій переносився у розчин рінгера А (який не містив іонів Mg), де перебував декілька хвилин, при температурі 20-25° С до переносу у розчин рінгера C із ферментами (Таб.2.1.а-с ).
- Дослідженням на поодиноких клітинах тригенімального ганглія передувала ферментативна обробка (Pronase-E 2mg\5mL, Colagenase 0.5mg\5mL, Sigma, Таб.2.1.с) відповідного ганглія продовж від 15 до 60 хвилин в залежності від зручних умов для виділення клітин при температурі 31° С.
Після обробки, з метою відмивання від зайвого залишку ферменту, тканина витримувалась у розчині Рінгера А 1-1.5 хвилини. Після ферментативної обробки гангліі переносилися у DМЕМ (Dulbecco's modified Eagl's medium) розчин, де перебували там, доки не були потрібні для використання. Поодинокі ізольовані клітини виділялися методом механічного руйнування обробленого ферментом ганглія тонкими хірургічними голками. Клітини перебували в Рінгері А (Таб.2.1) увесь час продовж експериментів при кімнатній температурі.
-Після препарації щура, клітини спинального ганглія були розташовані у штучному (DМЕМ) розчині і висаджені на скло. Після 4-6 годин клітини розростались, утворюючи культуру. Саме перед реєстрацією, клітина переносилося у Рінгер В, після чого проводилися записи відповідних струмів (Таб.2.1). Аналогічні дії були проведені для роботи із клітинами вузловатого ганглія (Таб.2.4) для отримання АТР-активованих струмів. Для отримання кальцієвого компоненту у зовнішньоклітинному розчині йони натрію боли замінені на NMDG (Таб.2.2)
- Після декапітації тварини обидві половинки гіпокампа швидко переносили до чашки Петрі, що містила охолоджений (+5оС) розчин А (Таб.2.3). Розчин постійно насичувався газовою сумішю О2 (95%) та CO2 (5%) для підтримання рН на рівні 7,35-7,4. Для запобігання травматичного пошкодження внаслідок гіперактивації NMDA рецепторів розчин для нарізання зрізів не містив іонів Са2+. Після охолодження гіпокамп переносили на покритий фільтрувальним папером плексигласовий столик із отворами для всмоктування рідини за допомогою водострумного насосу. Зрізи товщиною 300-600 мкм нарізали, використовуючи тонке лезо при постійному зволоженні поверхні гіпокампу. Після нарізання та відокремлення зрізи переносили до інкубаційної камери, де вони витримувалися протягом 30-60 хвилин при температурі +31оС перед експериментом. Цей час є необхідним для усуненя наслідків травми при нарізанні зрізів. За умови, що весь час від декапітації тварини до розділення гіпокампу на окремі зрізи не перевищував 15 хвилин, описана процедура дозволяла отримувати життєздатні зрізи, клітини з яких були придатні для досліджень від 2-7 годин. Реєстрацію електрофізіологічних показників проводили при кімнатній температурі у зовнішньоклітинному розчині В (Табл.2.3)
2.2 Електрофізіологічна реєстрація
Для дослідження трансмембранних іонних струмів крізь мембрану використовували метод patch-clamp. У конфігурації "whole-cell" (див Рис. 2.1). Основа методу полягає в утворенні гігаомного контакту між мембраною та внутрішніми стінками скляної піпетки, що заповнена відповідним розчином. Після того, як щільний контакт утворений, за рахунок штучно прикладеного від'ємного тиску мембрана проривається. Завдяки процесу дифузіїї, розчин скляної піпетки змішується з вмістом клітини. Прорив мембрани призводить до виникнення низькоомного контакту між внутрішнім середовищем клітини та розчином піпетки. Іонний склад основних розчинів, які використовувалися для дослідження наведені у Таб. 2 (2.1-2.4). Клітина за таких умов може бути вокористована протягом тривалого часу, необхідного для отримання ліганд-керованих струмів і проведення необхідних
Рис.2.1. Схематичне зображення фізичних процесів провідної мембрани.
експериментів. Струм, що протікає через мембрану вимірюють підсилювачем. Зареєстрований струм може бути розділений на індивідуальні іонні компоненти, що дає безпосередньо інформацію про активність іонних каналів та дозволяє дослідити функціональність ліганд-керованих рецепторів за потрібних умов. Електричні властивості збудливих мембран у багатьох випадках можна змоделювати за допомогою електричної схеми.
Еквівалента схема ділянки збудливої мембрані подана на Рис. 2.1. Вона демонструє електричний ланцюг з чотирма паралельними гілками. Одна з них містить електричну ємність С, інші гілки демонструють натрієву gNa, калієву gK, а також хлорну провідність gCl. Таким чином, загальний мембранний струм становить
Тобто, в умовах фіксації потенціалу струм, що тече через мембрану складається із двох складових: струму, що переноситься іонами, та струму, зумовленому перезарядкою мембрани. Метод фіксації потенціалу дозволяє змінювати мембранний потенціал за декілька мікросекунд, а потім утримувати його на новому постійному рівні. В результаті струм тече через ємність тільки протягом дуже короткого часу. Як тільки потенціал досягає свого стаціонарного значення, складова =0, (через те, що V-стала).
ЕК ЕNa ЕCl- це значення рівноважних потенціалів для відповідних іонів, розраховується за формулою
де [X]o, [X] I- зовнішньоклітинна та внутрішньоклітинна концетрацїї відповідного іона.
Загальна проблема використання методу petch-clamp полягає у фіксації потенціалу. Загальний потенціал який задається підсилювачем насправді в точності не дорівнює тому потенціалу який на клітині. Пов'язано це з тим, що загальній потенціал дорівнює сумі потенціалів на піпетці та на мембрані. Опір піпетки залежить від діаметру піпетки. Якщ