РОЗДІЛ 2
матеріали і методи досліджень
2.1. Матеріали
В роботі використoвували такі препарати:
глюкозооксидаза з Penicillium vitale з активністю 130 од.акт./мг виробництва
фірми “Діагностикум” (Львів, Україна);
глюкозооксидаза з Aspergillus niger з активністю 271 од.акт./мг виробництва
фірми “Genzyme” (Kent, UK);
глюкозооксидаза з Aspergillus niger з активністю 220 од.акт./мг виробництва
фірми “Fluka Chemie GmbH” (Buchs, Switzerland);
глюкозооксидаза з Aspergillus niger (type II) з активністю 16 од.акт./мг
виробництва фірми “Sigma-Aldrich Chemie GmbH” (Steinheim, Germany);
глюкозооксидаза з З Aspergillus niger (type II S) з активністю 47 од.акт./мг
виробництва фірми “Sigma-Aldrich Chemie GmbH” (Steinheim, Germany);
ацетилхолінестераза з електричного вугря з активністю 292 од.акт./мг
виробництва фірми “Sigma-Aldrich Chemie GmbH” (Steinheim, Germany);
бутирилхолінестераза з сироватки крові коня з активністю 13 од.акт./мг
виробництва фірми “Sigma-Aldrich Chemie GmbH” (Steinheim, Germany);
уреаза із бобів сої з активністю 31 од.акт./мг виробництва фірми „Fluka”
(Germany);
уреаза марки Б із бобів сої з активністю 12 од.акт./мг виробництва Олайнського
заводу хімреактивів (Литва);
b-лактамаза з Bacillus cereus з активністю 2150 од.акт./мг виробництва фірми
„Sigma” (USA);
алкогольоксидаза з Hansenula pоlymorpha з специфічною активністю 6 од.акт/мг
білку, люб'язно предоставлений д-ром Т. Гібсоном (Університет м.Лідс, Англія);
алкогольоксидаза з Hansenula pоlymorpha C-105 у вигляді суспензії в 50 мM
фосфатному буфері, рН 7.5, який містив 1 мМ EДTA та 70 % розчин (NH4)2SO4, з
активністю в розчині 114 од.акт/мл, люб'язно предоставлений д-ром Гончаром М.В.
(Інститут біології клітини, Львів, Україна);
тирозиназа (поліфеноксидаза; PPox) (EC1.14.18.1,) з грибів з активністю 6680
од. акт./мг виробництва фірми “Sigma-Aldrich Chemie GmbH” (Steinheim,
Germany);
трипсин з підшлункової залози свині активністю 1.000-2.000 од. БАЕЕ/мг
виробництва фірми “Sigma-Aldrich Chemie GmbH” (Steinheim, Germany).
Також в роботі використовували сиворотковий альбумін бика (БСА) та 25 % розчин
глутарового альдегіду фірми “Sigma-Aldrich Chemie GmbH”, Steinheim, Germany.
Субстрати глюкоза, сечовина, ацетилхолін хлорид, бутирилхолін хлорид,
пеніцилін, параформальдегід, Na-бензоїл-L-аргінін етиловий ефір (БАЕЕ), БСА,
4-хлорофенол, фенол, катехол були виробництва фірми “Sigma-Aldrich Chemie GmbH”
(Steinheim, Germany).
Як токсичні речовини, що використовувалися для аналізу через інактивацію
ферментів, були: фосфорорганічні пестициди: трихлорфон
[(dimethyl–2,2,2-trichlor–1–hydroxyethyl)-phosphonat], діізопропіл-фторфосфат,
параоксон-етил [diethyl-p-nitrophenyl phosphate], параоксон-метил
[O,O-dimethyl-O-(4-nitrophenyl)-phosphate], паратіон-метил
[(O,O-dimethyl-O-(4-nitrophenyl)-phosphorothiate] фірми „Riedel-de-Haen
(Швейцарія)”; карбаматний пестицид карбофуран
[2,3–dihydro–2,2–dimethylbenzofuran–7–yl N-methylcarbamate] фірми
„Riedel-de-Haen” (Швейцарія), глікоалкалоїди a-чаконін (95 % чистоти),
a-соланін (95 % чистоти) з паростків картоплі, томатін (Lycopersicin) (98 %
чистоти), деміссідін (соланін D), езерін (Physostigmine) та аглікони соланідін
(98 % чистоти) з паростків картоплі, томатідін (3b-Hydroxy-5a-tomatidane),
соласодін (Solasod-5-en-3b-ol) (99 % чистоти), атразин
(2-хлор-4-етиламін-6-ізопропіламін-1,3,5-триазин) (CAS: 1912-24-9, EC 2176178),
діурон (3-(3,4-діхлорофенил)-1,1-діметилуреа) (CAS: 330-54-1, EC: 2063544),
бромоксиніл (3,5-дібром -4-гідроксибензонітрил) (CAS: 1689-84-5, EC: 2168827),
дезетилатразин (2-амін-4-хлор-6-ізопропіламін-1,3,5-тріазин) (CAS: 6190-65-4) і
дезізопропілатразин (6-хлор-N-етил-1,3,5-тріазин-2,4-діамін) (CAS: 1007-28-9)
фірми “Sigma-Aldrich Chemie GmbH” (Steinheim, Germany).
Для інактивації уреази іонами важких металів використовували водні розчини
таких солей: Hg(NO3)2, Cu(NO3)2, Pb(NO3)2, Co(NO3)2, Cd(NO3)2, AgNO3,
Sr(NO3)2.
Матеріали для створення біоселективних та додаткових мембран: нафіон -
катіонообмінний полімер (5 % в суміші низько-молекулярних аліфатичних спиртів
та 10 % води, продукт № 27.470-4) та полі(4-вінілпіридин-ко-стірен) полімер
(ПВП), продукт № 19,207-4) були поставлені фірмою „Aldrich Chem. Co.” (США).
Як робочий буфер використовували калій-фосфатний розчин (КН2РО4-NaOH)
вітчизнянного виробництва. Всі інші реактиви були вітчизняного та імпортного
виробництва і мали кваліфікацію “ос.ч.” чи “х.ч.”.
2.2. Іммобілізація ферментів на поверхні перетворювача
Для створення біоматриць за основу був взятий метод іммобілізації ферментів,
розроблений в нашій лабораторії та оптимізований для кожного конкретного
перетворювача та ферменту. Для цього готували розчини ферменту та БСА у, як
правило, 20 мМ фосфатному буфері, рН 7,5 з кінцевими концентраціями 50 мг/мл та
змішували у співвідношенні 1:1. До суміші фермент-БСА додавали гліцерин до
кінцевої концентрації 10 % для стабілізації ферменту при іммобілізації та
запобігання передчасному підсиханню розчину, нанесеного на поверхню
перетворювача. Краплю суміші фермент-БСА наносили на одну частину чутливої
поверхні перетворювача, на іншу - розчин БСА без ферменту (це був датчик
порівняння). Для полімеризації мембран датчики розміщували в атмосфері
насичених парів ГА на 20-30 хв і потім підсушували на повітрі й відмивали від
надлишкку глутарового альдегіду у буферному розчині протягом 10-20 хв.
Для електрохімічного нанесення полімерної матриці на робочий електрод
використовували таку суміш: 50 мкл розчину полімеру (30
- Киев+380960830922