СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.......................................................................6
♦
Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................10
1.1. Фотофизика и фотохимия индола, триптофана и их производных............10
1.1.1. Спектры поглощения основного состояния...........................10
1.1.2. Возбужденные триплетныс состояния................................11
1.1.2.1. Спектры поглощения..........................................11
1.1.2.2. Коэффициенты экстинкции.....................................13
1.1.2.3. Выходы интеркомбинационной конверсии........................14
1.1.2.4. Время жизни.................................................14
1.1.3. Свойства радикалов...............................................16
1.1.3.1. Радикалы, образующиеся в реакциях окисления.................16
1.1.3.2. Радикалы, образующиеся в реакциях восстановления............18
1.1.4. Реакции синглетного возбужденного состояния......................18
1.1.4.1. Реакции переноса протона....................................18
* 1.1.4.2. Фотоионизация индола, триптофана и их производных...........20
1.2. Фотофизика и фотохимия нуклеиновых кислот и их компонентов............24
1.2.1. Строение нуклеиновых кислот......................................24
1.2.2. Спектры поглощения компонентов нуклеиновых кислот................25
1.2.3. Фотохимические реакции нуклеиновых кислот и их компонентов.......26
1.2.4. Применение метода ХПЯ к изучению фотохимических реакций с участием молекул нуклеиновых кислот и их компонентов............................27
1.3. Постановка задачи.....................................................30
Глава II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.............................................31
2.1. Методы исследования...................................................31
2.1.1 Установка лазерного импульсного фотолиза..........................31
2.1.2. Установка химической поляризации ядер с временным разрешением 34
^ 2.1.3. pH- и спектрофотометрия.........................................38
2.1.4. Актинометрия.....................................................39
2.2. Материалы и реактивы..................................................39
2
Глава III. ИЗУЧЕНИЕ ФОТОХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ ТРИПТОФАНА В
ВОДНЫХ РАСТВОРАХ.........................................................40
3.1. Свойства возбужденных состояний триптофана......................40
3.1.1. Спектроскопические характеристики интермедиатов триптофана..40
3.1.2. Кинетические характеристики.................................43
3.1.3. Измерение квантового выхода триплета триптофана.............46
3.1.4. Константы скорости и квантовые выходы.......................50
3.1.5. Природа короткоживущего интермедиата........................52
3.2. Фотоионизация триптофана........................................54
3.2.1. Предшественник фотоионизации триптофана.....................54
3.2.2. Зависимость выхода фотоионизации от энергии лазерного облучения 55
3.2.3. Зависимость квантового выхода фотоионизации от температуры для М-ацетилтриптофана (ЫАТгрН)..........................................57
3.2.4. Зависимость квантового выхода фотоионизации от температуры для Ь-триптофана (Ь-ТгрН)................................................59
3.2.5. Зависимость от температуры реакции внутримолекулярного переноса электрона для Ь-ТгрН...............................................60
3.2.6. Реакции синглетного состояния триптофана....................62
3.2.7. Численное моделирование реакций ионизации и ВПП.............65
3.3. Количественная модель фотолиза триптофана.......................67
3.4. Заключение......................................................69
Глава IV. ИССЛЕДОВАНИЕ ФОТОХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ И МЕХАНИЗМОВ ФОРМИРОВАНИЯ ХПЯ ПРИ ФОТОЛИЗЕ ВОДНЫХ РАСТВОРОВ 2,2'-
ДИПИРИДИНА С ГУАНОЗИН-5'-МОНОФОСФАТОМ....................................72
4.1. Лазерный импульсный фотолиз растворов дипиридина с нуклеотидом..74
4.2. Исследование эффектов ХПЯ.......................................79
4.3. Заключение......................................................86
Глава V. ФОТОХИМИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ ТРИПЛЕТНОГО ТРИПТОФАНА С
НУКЛЕОТИДАМИ............................................................88
5.1. Лазерный импульсный фотолиз растворов триптофана в присутствии нуклеотидов......................................................... 89
5.2. Эффекты ХПЯ.....................................................95
3
5.3. Заключение..............................................100
ВЫВОДЫ..........................................................101
* СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ..........................................103
ч
*
*
4
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ХПЯ химическая поляризация ядер
ЛИФ лазерный импульсный фотолиз
ВПП (ipt) внутримолекулярный перенос протона (от англ. intramolecular proton transfer)
ВЭО вырожденный электронный обмен
ИКК интеркомбинационная конверсия
ion ионизация (от англ. ionization)
Nuc нуклеотид
ГМФ (G) гуанозин-5’-монофосфат, гуанилат
АМФ аденозин-5’-монофосфат, аденилат
ЦМФ цитидин-5’-монофосфат, цитидилат
УМФ уридин-5’-монофосфат, уридилат
L-TrpH L- триптофан
NATrpH N-ацетилтриптофан
NATA N-ацетил триптофан амид
Ш индол
АА акри л амид
Ас ацетон
DP 2,2’-дипиридин
FMN ф лави н мононуклеотид
т
5
ВВЕДЕНИЕ
Жизнь на Земле возникла и развивалась благодаря поглощению излучения. Несколько миллиардов лет назад под действием солнечного ультрафиолетового излучения, свободно проникавшего сквозь первозданную разбавленную атмосферу нашей планеты, ионизирующих излучений радиоактивных элементов и тепла вулканов синтезировались сложные органические молекулы, и началась пребиотичсская эволюция, приведшая к созданию анаэробных организмов. Фотосинтез возник и стал развиваться позже, когда в земной атмосфере появились кислород и озон, защищающие поверхность планеты от воздействия солнечной УФ-радиации. В это время гетеротрофы - организмы, использовавшие для своего питания органические соединения, синтезируемые под действием ультрафиолетового излучения, исчезли, уступив свое место автотрофам -организмам, содержащим порфирины и обладающим способностью синтезировать собственную пищу, поглощая энергию видимого света. Фотосинтез снабжал и до сих пор снабжает все живые организмы энергией, необходимой для развития. Солнечный свет к тому же позволяет многим живущим организмам видеть свое окружение. Однако ионизирующее, ультрафиолетовое или видимое излучения оказывают и вредное воздействие на жизнедеятельность клеток. Они способны повреждать биологические молекулы, что приводит к изменению их активности или гибели клетки.
Белки, составляющими которых являются аминокислоты, участвуют во многих биологических процессах, а ультрафиолетовое излучение и ионизирующая радиация изменяют многие их свойства. С точки зрения фотобиологии триптофан наиболее важен, так как его спектр поглощения основного состояния перекрывается со спектром солнечной радиации, достигающей земной поверхности. Поэтому его фотовозбуждение может приводить к таким процессам, как фотоинактивация ферментов и фотоиндуцированное повреждение белков, приводящие к развитию различных заболеваний, в первую очередь кожи и органов зрения. Очевидно, что фотохимические реакции водных растворов триптофана могут существенно отличаться от реакций, протекающих в живых организмах. Это связано с тем, что, во-первых, в живых клетках триптофан ильные остатки находятся в составе белковых молекул, а, во-вторых, реакции в молекулярно-организованных средах (которыми являются биологические растворы) могут отличаться от реакций в гомогенных растворах. Тем не менее, исследование фотовозбужденных состояний триптофана и их реакций является важным шагом для понимания механизмов фотохимических реакций, протекающих в живой природе. В
связи с этим в течение последних десятилетий фотохимия триптофана активно изучалась рядом научных коллективов. Однако, несмотря на это, до сих нор не существует детального количественного описания фотохимических реакций с участием этой аминокислоты.
Наиболее тяжелые последствия воздействия избыточного УФ облучения для людей связаны с повреждениями молекул нуклеиновых кислот. Реакции, вызванные прямым облучением структурных элементов нуклеиновых кислот - нуклеотидов ионизирующим или жестким ультрафиолетовым облучением, изучены достаточно хорошо. Однако основную опасность повреждения ДНК и РНК представляет не прямой, а сенсибилизированный фотолиз, так как сами нуклеиновые кислоты в видимом и ближнем УФ диапазонах прозрачны. Известно, что некоторые аминокислоты (триптофан, тирозин) способны поглощать свет в области длин волн 280-300 нм (то есть в диапазоне солнечного света) с образованием высокореакционных интермедиатов. Поскольку в живых организмах белки связываются с молекулами нуклеиновых кислот (например, в процессе транскрипции), то образующиеся интермедиаты могут вступать в реакции с азотистыми основаниями нуклеиновых кислот и вызывать химические повреждения последних. В связи с этим возникает необходимость в исследовании фотохимических реакций, вызванных облучением аминокислот, наиболее интенсивно поглощающих в области ближнего УФ диапазона (в первую очередь триптофана), в присутствии различных нуклеотидов. Таким образом, исследование свойств интермедиатов, образующихся при фотолизе растворов как самого триптофана, так и в присутствии нуклеотидов, имеет фундаментальное значение для фотохимии и фотобиологии.
В настоящее время взаимодействие излучений с биомолекулами является главным объектом исследования многих научных дисциплин, использующих различные методы. Основным вопросом всех исследований, прежде всего, является выяснением механизма реакций. Важнейшую роль в изучении механизмов фотохимических реакций с участием биомолекул играют современные кинетические методы. Как правило, эти методы основаны на импульсном возбуждении химической реакции с последующей регистрацией временной эволюции как исходных реагентов и конечных продуктов реакции, так и промежуточных частиц, возникающих в ходе реакции. Для импульсного инициирования реакции используют реакторы быстрого смешивания (для реакций смешения), а также импульсное облучение образца светом лазера или потоком ионизирующих частиц (для фото- и радиохимических реакций). Для регистрации проходящих в исследуемой системе изменений используется большое количество
различных методов, среди которых важное место занимают методы спиновой химии. Эти методы основаны на использовании явлений спиновой поляризации (ХПЯ - химическая поляризация ядер и ХПЭ - химическая поляризация электронов), возникающей в ходе радикальных химических реакций. Ядерная поляризация формируется за наносекунды в продуктах геминальной рекомбинации, но сохраняется в диамагнитных продуктах реакции в течение времени ядерной релаксации (порядка секунды) и может быть использована как спиновая селективная неразрушающая метка на молекуле биополимера. К преимуществу этого метода относится также его более высокая чувствительность по сравнению с обычными методами ЭПР и ЯМР, связанная с высокой степенью поляризации исследуемых образцов. Кроме того, современные методы позволяют проводить исследование кинетики формирования спиновой поляризации в микросекундном и субмикросскундном временных диапазонах, что в сочетании со спектральной информативностью, свойственной ЭПР и ЯМР, делает эти методы незаменимыми при исследовании механизмов быстрых радикальных реакций. Информация о механизме реакции может быть получена из анализа знаков, амплитуды и кинетики формирования сигналов поляризации. Поскольку спектры ХПЯ возникают в результате взаимодействий радикальных частиц, детальное изучение этих спектров и кинетики их эволюции позволяет сделать важные выводы о магнитных и кинетических свойствах этих интермедиатов. Следует заметить, что каждый метод сам по себе способен дать только ограниченную информацию о механизме исследуемой реакции, и для детального исследования необходимо комплексное использование ряда методов.
Настоящая работа посвящена исследованию кинетики и механизмов фотохимических реакций с участием структурных элементов биологических молекул -аминокислот и нуклеотидов, а также изучению свойств и взаимодействий короткоживущих промежуточных частиц, возникающих в ходе этих реакций. Исследования проводились с использованием комплексного подхода, основанного на совместном применении магнитнорезонансного и оптического методов: метода ХПЯ с временным разрешением и метода лазерного импульсного фотолиза (ЛИФ).
Цель диссертационной работы состояла в определении физико-химических свойств интермедиатов, образующихся при фотолизе триптофана, в установлении механизма реакций этих интермедиатов с нуклеотидами и определении свойств образующихся радикалов, в выяснении влияния параметров среды (pH, температура) на эти реакции, а также в установлении механизма фотохимических реакций между одним
из нуклеотидов и фотовозбужденными аза-ароматическими красителями и механизмов формирования ХПЯ в этих реакциях.
В первой главе диссертации дан обзор литературы по фотофизике и фотохимии индола, триптофана и родственных им соединений. Рассмотрены примеры основных фотохимических реакций, а также свойства радикалов и возбужденных состояний, образующихся при фотолизе этих молекул. В этой же главе дан обзор работ по изучению фотохимических реакций с участием нуклеиновых кислот и их компонентов. Приведены примеры использования физико-химических методов для изучения этих реакций.
Во второй главе описаны методики проведения экспериментов.
Третья глава диссертации посвящена исследованию фотохимических реакций, протекающих при фотолизе триптофана. Представлены результаты изучения эволюции и свойств образующихся интермедиатов, изучен механизм реакции фотоионизации триптофана, приведена целостная схема фотолиза данной аминокислоты.
В четвертой главе изучены механизмы фотохимических реакций между триплетным красителем и одним из оснований нуклеиновых кислот (гуанозин-5’-монофосфат) в водных растворах, а также изучены механизмы формирования эффектов ХПЯ в этих реакциях. В результате проделанной работы был установлен механизм тушения триплетного состояния красителя нуклеотидом, определены константы скорости реакций в широком диапазоне pH водных растворов, и установлены особенности формирования эффектов ХПЯ в водных растворах.
Пятая глава диссертации посвящена исследованию фотоиндуцированных реакций между триптофаном и различными нуклеотидами. Исследованы реакции между триплетным триптофаном и нуклеотидами, обсуждается механизм этих реакций.
В конце диссертации перечислены основные результаты и приведен список цитируемой литературы.
9
- Київ+380960830922