СОДЕРЖАШ1Е
ВВЕДЕНИЕ...................................................... 6
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..................................... 13
1.1. Современные методы анализа соединений с пептидной структурой................................................... 13
1.1.1. Спектроскопические методы анализа..................... 13
1.1.2. Хроматографические методы анализа..................... 17
1.2. Химические, физические и физико-химические свойства ноопепта..................................................... 20
1.3. Стандартные образцы в анализе лекарственных средств...................................................... 25
1.3.1. Национальные требования к стандартным образцам........ 25
1.3.2. Стандарты сравнения в Фармакопее США.................. 33
ВЫВОДЫ ИЗ ОБЗОРА ЛИТЕРАТУРЫ................................... 36
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ....................... 37
ГЛАВА 3. АНАЛИЗ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ НООПЕПТА ДЛЯ РАЗРАБОТКИ ГСО............................................... 39
3.1. Получение исходного материала для создания ГСО ноопепта 39
3.2. Контроль качества стандартных образцов (СО) субстанции ноопепта..................................................... 41
3.2.1. Результаты определения фармакопейных показателей
качества...................................................... 41
3.2.2. Спектральные характеристики СО ноопепта................ 44
3.2.2.1. Спектроскопия в инфракрасной области................ 44
3.2.2.2. ЯМР'П -спектроскопия................................ 46
3.2.2.3. УФ-спектроскопия.................................... 51
3.2.2.4. Масс-спектроскопия.................................. 54
/
3
3.3. Хроматографический анализ СО ноопепта методом ВЭЖХ 56
3.3.1. Определение посторонних примесей в субстанции СО
ноопепта....................................................... 56
3.3.1.1. Определение калибровочных коэффициентов............... 63
3.3.1.2. Проверка пригодности хроматографической системы....... 67
3.3.1.3. Методика определение содержания посторонних примесей в СО ноопепта.................................................... 69
3.4. Результаты анализа СО ноопепта по всем показателям и ф разработанным методикам......................................... 71
3.5. Изучение стабильности субстанции ГСО ноопепта и установление сроков годности................................... 73
3.5.1. Изучение гигроскопичности субстанции СО ноопепта........ 73
3.5.2. Изучение стабильности субстанции СО ноопепта при хранении....................................................... 74
3.6. Установление норм качества СО ноопепта.................... 77
ВЫВОДЫ......................................................... 79
ГЛАВА 4. АНАЛИЗ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ СУБСТАНЦИИ НООПЕПТА ДЛЯ СОЗДАНИЯ ИНЪЕКЦИОННЫХ
# ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ.............................................. 80
4.1. Физико-химические свойства и спектральные характеристики субстанции ноопепта для инъекций............................... 80
4.1.1. Спектроскопия в инфракрасной области.................... 83
4.1.2. УФ-спектроскопия........................................ 85
4.1.3. ЯМР-спсктроскопия....;.................................. 87
4.2. Определение посторонпих примесей в субстанции ноопепта для инъекционных лекарственных форм методом ВЭЖХ................... 88
Высокая полярность и низкая летучесть пептидов требует их перевода в более летучие производные для проведения газохроматографического исследования [131], например, в метиловые эфиры М-гептафторбутилпептидов [69, 98, 134], Ы-трифторацетилпроизводные [74, 131-133] или бутиловые [103] эфиры. Например, в работе [116] синтетические дипептиды, содержащие смеси энантиомеров и диастереомеров переводились в эфиры М-псрфторацетида при комнатной температуре (перфторацетил: трифторацетил, пентаф горацетил; эфиры: метиловый, 1-пропиловый, 2-пропиловый, 2,2,2-трифторэтиловый) и анализировались на хиральных стационарных фазах СЫгаэН^-Ь-Уа! и 1лрос1ех®-Е с использованием гелия в качестве газа-носителя.
В настоящее время методом ГЖХ анализируют только ди-, три-, тетра-, и пентапептиды. Разделение пептидов проводят на колонках (преимущественно стеклянных), заполненных неполярными неподвижными фазами (1-5% 8Е-30, 8Е-52, ОУ-1, ОУ-17, ОУ-Ю1) [95, 132]. Для определения первичной структуры пептидов описана методика, основанная на разделении триметилсилильных производных дипептидов на кварцевой капиллярной колонке, покрытой фазой 8Р-2100. При расщеплении пептидов дипептидиламинопептидазой образующие аминокислоты могут быть идентифицированы с применением масс-спектрометра [75].
• Тонкослойном хроматография (ТСХ). Такие преимущества метода ТСХ как дешевизна, простота использования, возможность одновременного анализа нескольких образцов и автоматизированного нанесения образцов на пластинку, применение ТСХ под давлением, наличие микрогранулированных
и гомогенных носителей для ТСХ, циркуляционная и многомерная ТСХ позволяют эффективно использовать этот метод и сегодня [2, 5, 6, 10. 40].
Разделения пептидных соединений проводят на слоях силикагель-гипс, целлюлозе, сефадексе [2] и полиамидах [40] используя нормально-фазовый или ионно-обменный варианты ТСХ, а также применяя двумерное разделение [40]. Иногда в методе ТСХ используют так называемые градиентные слои [63].
Детектирования пептидных соединений на хроматограмме проводят опрыскивая пластинки 0.2-2% раствором нингидрина в различных растворителях и прогревая до 105°С в течение 20 минут. Аминокислоты и пептиды на пластинке проявляются в виде темнофиолетовых пятен [2, 40]. Или применяют опрыскивание пластинок флуоресцентными красителями (более чувствительный метод), например 0.01% раствор флуоросциамина в ацетоне, и помещают в УФ-свет [40, 115].
1.2. Химические, физические и физико-химические свойства ноопепта
По химической структуре ноопепт представляет собой этиловый эфир М-фенилацетил-Ь-пролилглицина:
Для ноопепта характерно наличие двух основных функциональных групп: амидной (пептидной), образованной остатком пролина и глицина, и сложноэфирной группы остатка глицина.
Брутто-формула:
М.м. 318,39
- Київ+380960830922