Оглавление
Актуальность 4
Цель и задачи работы 6
Защищаемые положения 6
1 Глава 1. Введение во флуоресцентную диагностику 8
1.1 Природа флуоресценции 7
1.2 Методы регистрации флуоресценции и принципы соответствующей целевой аппаратуры 13
1.3 Методы диагностики на основе регистрации флуоресценции природных флуорофоров для биологи и медицины 16
1.4 Методы диагностики на основе экзогенной флуоресценции 26
1.5 Методы обработки результатов ЛФД 27
1.6 Диагностика объектов микробной природы, состояние проблемы и возможные пути ее решения на основе ЛФД 32
2 Глава 2. Экспериментально-теоретическое исследование. Материалы и методы. 36
2.1 Проблемная база для выполнения работы. 36
2.2 Аппаратура спектральной лазерной флуоресцентной диагностики 37
2.3 Особенности флуоресценции биологических субстратов с микроорганизмами 39
2.4 Модель распознавания спектральных флуоресцентных данных и метод ее математического решения 44
2.5 Практическое и теоретическое планирование эксперимента по накоплению базы данных эталонных образцов для решения задачи распознавания 50
2.6 Восстановление корректных спектров с учетом характеристик оптической экстинкции вещества 51
3 Глава 3. Наработка базы данных и исследование спектральных характеристик различных микобактерий для дифференциальной флуоресцентной диагностики. 54
3.1 Измерения и обработка спектров флуоресценции 54
3.2 Индивидуальные особенности микробов 62
3.3 Разработка модели с учетом корректировки спектральных данных с помощью спектров экстинкции исследуемых веществ 68
4 Глава 4. Применение детергента для повышения чувствительности дифференциальной лазерной флуоресцентной диагностики микроорганизмов.
71
4.1 Механизм увеличения интенсивности флуоресценции под действием детергента 71
4.2 Измерение флуоресценции микроорганизмов под влиянием различных детергентов и определение динамики 73
4.3 Анализ специфичности флуоресценции микобактерий при их обработке с использованием мирамистина 79
5 Глава 5. Диагностика заболеваний туберкулеза по измерению флуоресценции плазмы крови 89
5.1 Схема распознавания и классификации болезни 89
5.2 Сбор и организация данных лазерно-флуоресцентной диагностики
90
5.3 Экспериментальная установка и процедура тестирования 91
5.4 Результаты исследования 93
Выводы работы 99
Научная новизна и практическая значимость 100
Список литературы 101
3
Актуальность
Возникновение флуоресцентного анализа и диагностики с применением лазеров привело к созданию эффективных методов дистанционного и бесконтактного исследования различных субстратов органического происхождения с достижением большой чувствительности метода. Качество диагностики в этом случае во многом обусловлено временной и пространственной когерентностью возбуждающего излучения. Лазерно-индуцированная флуоресценция (ЛИФ) успешно применяется при определении участков загрязнения нефтепродуктами, в том числе аварийного состояния нефтепроводов (технология LDI). В таможенных службах используются приборы ЛИФ для определения наличия наркотиков (NarTest€>). В медицине ЛИФ применяется в качестве диагностического средства при фотодинамической терапии онкологических заболеваний. Основная задача, решение которой позволит увеличить возможности этих и подобных методов, заключается в разделении компонентных вкладов во флуоресцентный сигнал от многокомпонентной смеси сложных многоатомных молекул.
В связи с прогрессом в лазерных методах лечения заболеваний, связанных с микробной флорой, что привело к существенному сокращению сроков лечения, возникла острая необходимость в экспрессных методах диагностики заболеваний. Это необходимо по двум причинам. Первая -лекарственная терапия сильнодействующими препаратами в избыточных дозах приводит к ухудшению состояния жизненноважных органов. Поэтому необходимо, вовремя определить момент прекращения лекарственной терапии. Вторая - в процессе лечения очень важно отслеживать динамику лечения для его коррекции. Существующие методы диагностики, основанные на микробиологическом анализе, требуют длительного времени для установления диагноза (например, диагностика туберкулеза занимает от 3-х до 6-ти недель.)
Развитие новых методов диагностики на основе исследования характеристик конверсии (рассеяние, флуоресценция, рамановский и нелинейный эффекты и т.п.) лазерного излучения в биологическом веществе имеет проблемный и приоритетный характер в целях диагностики для медицины, и кроме нее также для биологии, промышленности и т.д., поскольку эти методы являются прямой базой новой экспресс - диагностики, которая лишена ряда недостатков остальных способов и имеет неоспоримые преимущества. Из них лазерная флуоресцентная диагностика может сочетать в себе приемлемые для задач диагностики чувствительность и специфичность. Однако сейчас наиболее часто флуоресцентный метод применяется с использованием специфических флуоресцирующих веществ, которые связываются с иммунными телами, специфическими к своему типу микроорганизмов [1,2]. Это связано с тем, что сама по себе эндогенная флуоресценция трудно поддается специфическому анализу. Но все-таки были разработаны методы диагностики для некоторых чистых культур [3].
4
Несмотря на это методы определения видов микроорганизмов в смесях не разработаны. Такие методы были бы полезны не только в медицинской диагностике, но и, например, в фармакологии для определения чувствительности возбудителя к антимикробным препаратам. Так же это было бы востребовано в пищевой технологии, экологии, промышленности, в космических и биосферных исследованиях.
Разработка экспресс-методов индикации и идентификации микроорганизмов является приоритетным направлением в медицинской диагностике. По оценкам ВОЗ, болезни микробной природы продолжают оставаться серьезной проблемой здравоохранения многих стран. Острые диарейные заболевания являются причиной более чем 30% смертных случаев среди детей до 5 лет. Острые респираторные заболевания (первичная пневмония) являются причиной смерти 2.2 млн. человек в год [4]. Существующие методы недостаточно быстро позволяют проводить диагноз. Бактериологическое исследование клинического материала от больного, одной из целей которого является выделение и идентификация бактерий, существенно зависит от качества работы на лабораторном и долабораториом этапах. Также здесь необходимо наличие аэробной и анаэробной микробиологической техники исследования материала, которая остается не всегда доступной лабораториям практического здравоохранения. Э ти методы трудоемки и требуют слишком много времени.[5]
Выше сказанное обосновывает необходимость разработки новых экспресс-методов диагностики и мониторинга заболеваний микробной природы. Целесообразным для решения указанной проблемы является, например использование метода ЛФД. ЛФД обладает рядом потенциальных преимуществ, благодаря которым возможно эффективное решение данной проблемы. Особенно важны здесь преимущества в скорости диагностики и потенциальной неинвазивности.
Однако при применении ЛФД есть несколько проблем, среди которых особенно важна проблема скрытой специфичности. Спектры флуоресценции биологических объектов, в частности микробосодержащих жидкостей, не имеют характерных деталей, посредством которых можно было бы идентифицировать их. Специфические особенности не проявляются в виде узких спектральных линий, а наоборот, рассредоточены по широким перекрывающимся пикам. Поэтому для их анализа требуются методы, позволяющие находить и учитывать эти особенности в широких спекграх. При этом ЕСроме высокой специфичности необходимо добиться одновременно и большой чувствительности, поскольку порог обнаружения и определения концентраций микроорганизмов может оказаться слишком высоким, чтобы не определить содержание микроорганизмов в слабоконцентрированных суспензиях.
Все приведенные доводы указывают на необходимость поиска новых методов определения и идентификации микроорганизмов на основе экспрссс-метода ЛФД. Также это относится к достижению необходимых качеств диагностики, таких как чувствительность, дешевизна и экспрессность.
5
Специфичность флуоресценции микробосодержащих взвесей слабо выражена и была недостаточно исследована к моменту начала работы, и эго отражается в неспособности ЛФД без необходимого аналитического инструментария анализировать и диагностировать смеси различных микроорганизмов. Поэтому целью данного исследования является разработка метода и аппаратуры для объективной оценки специфичности флуоресценции нативных биологических субстратов (микробов) и их смесей в микробосодержащих жидкостях. В рамках достижения поставленной цели решаются задачи набора спектров флуоресценции нескольких видов микробов в зависимости от концентраций, составления метода, алгоритма и программного обеспечения дифференциальной диагностики микробов в составных взвесях и поиска способов улучшения диагностических качеств снимаемых данных при помощи использования детергента для увеличения относительной интенсивности флуоресценции и учета влияния некоторых оптических характеристик среды на спектры флуоресценции.
Цель и задачи диссертационной работы
Цель: Исследование и разработка метода дифференциальной диагностики объекгов микробной природы на основе спектральных измерений лазерно-индуцированной флуоресценции.
Задачи:
1. Экспериментально-теоретическое обоснование и метод обработки диагностических данных с целыо дифференциации и видовой идентификации микробосодержащих биологических субстратов.
2. Экспериментальное и исследование флуоресценции биологических субстратов, взятых непосредственно от пациентов.
3. Исследование флуоресценции различных микробов и их дифференциация методами многомерного статистического анализа.
4. Повышение эффективности видовой идентификации микробов на основе учета характеристик рассеивания и поглощения биологического субстрата, содержащего флоурофоры микробов.
5. Осуществление программной реализации дифференциальной диагностики микробосодержащих биологических субстратов.
6. Тестовые испытания разработанной системы дифференциальной диагностики, возможности и перспективы.
6
Защищаемые положения
1. Применение методов многомерного статистического регрессионного анализа данных лазерной флуоресцентной диагностики биологических веществ позволяет эффективно проводить дифференциальную диагностику ассоциаций микроорганизмов.
2. При восстановлении спектров лазерной ндуцированной флуоресценции с учетом оптических характеристик вещества точность и эффективность дифференциальной диагностики повышается.
3. Добавление в суспензии микроорганизмов препарата на основе детергента увеличивает интенсивность флуоресценции и повышает чувствительность лазерной флуоресцентной диагностики.
7
Глава 1. Введение во флуоресцентную диагностику
1.1 Природа флуоресценции
Люминесценция - испускание фотонов из электронно-возбужденных состояний - делится на два типа в зависимости от скорости процесса и природы основного и возбужденного состояний. В синглетном возбужденном состоянии электрон на энергетически более высокой орбитали и второй электрон на орбитали с более низкой энергией имеют противоположную ориентацию спинов. Говорят, что спины этих электронов спарены. В триплетном состоянии эти электроны не спарены по спинам, т.е. их спины имеют одинаковую ориентацию. При возвращении электрона из возбужденного синглетного состояния в основное ориентация его спина не должна меняться. Изменение ориентации спина необходимо при переходе из гриплетного состояния в синглетное основное состояние. Флуоресценция -это испускание, происходящее за короткое время, обычно при возвращении спаренного электрона на более низкую орбиталь. Такие переходы квантовомеханически ''разрешены", а типичные величины скоростей испускания для них ~10ь с*1. Высокие значения скоростей испускания приводят к временам затухания флуоресценции~10‘ь с (10 не). Фосфоресценция — это испускание, происходящее за более длительное время, обыкновенно при переходе между состояниями различной мультнплетности. Типичный диапазон времени затухания фосфоресценции — от миллисекунд до секунд, что главным образом зависит от вклада других процессов дезактивации. [6]
Длина Анны, нм 350 370 030 410 450
35500 31500 27500 23500 • 19500 15500
- Київ+380960830922