2
Оглавление
Введение 5
Глава 1. Фуллерен и фото динамическая инактивация вирусов 12
1.1. Фотосенсибилизируемые реакции 12
1.2. Фотодинамическая терапия, активные формы кислорода 14
1.3. Инактивация вирусов в плазме и препаратах плазмы крови 18
1.4. Фотосенсибилизаторы: фуллерен или красители 23
1.5. Функционализированные фуллерены 26
1.6. Особенности применения твердофазных
фотосенсибилизаторов 27
1.7. Влияние степени агрегации молекул фуллсрена на времена жизни уровней Ті и Бі 28
1.8. Влияние аїрегации молекул фуллсрена на генерацию активных форм кислорода 35
1.8.1. Снижение квантового выхода синглетного кислорода при агрегации молекул фуллерена 35
1.8.2. Образование радикалов фуллерена 36
1.9. Выводы 38 Глава 2. Разработка и получение твердофазных фотосенсибилизаторов
на основе фуллеренов. Изучение их структурных свойств 41
2.1. Введение 41
2.2. Методическая часть 42
2.3. Электронные спектры поглощения фуллеренов и агрегация 43
2.4. Получетгие и структурные свойства суспензии раздробленного кристаллического фуллсрена в воде 49
2.5. Получение и структурные свойства водной суспензии «аморфного» фуллерена 54
2.6. Покрытия на основе фуллеренов на плоских поверхностях 63
2.7. Фуллерены, нанесенные на микрочастицы силикагеля 64
2.8. Выводы 69
3
Глава 3. Генерация синглетного кислорода твердофазными фотосенсибилизаторами на основе фуллерена 70
3.1. Введение 70
3.2. Методы обнаружения синглетного кислорода 71
3.3. Импульсная люминесценция 73
3.4. Выбор химического метода обнаружения ‘СЬ 78
3.5. Модификация фотохимического метода определения синглетного кислорода. Экспериментальная установка 82
3.6. Метод расчета стационарной концентрации синглетного кислорода с помощью эталонного фотосенсибилизатора 87
3.7. Генерация синглетного кислорода твердофазными фотосенсибилизаторами на основе фуллеренов 90
3.8. Анализ удельных величин стационарной концентрации синглетного кислорода 94
3.9. Потенциальные возможности фуллерена, нанесенного на микрочастицы силикагеля, в качестве фотосенсибилизатора синглетного кислорода в модельной водной среде, не содержащей электронодонорных соединений 102
3.10. Выводы 107
Глава 4. Изучение фотостабильности фуллереновых покрытий в составе твердофазных фотосенсибилизаторов синглетного кислорода 109
4.1. Введение 109
4.2. Методическая часть 110
4.3. Результаты и обсужде» iие 113
4.4. Выводы 120
Глава 5. Изучение принципиальных возможностей твердофазных фотосенсибилизаторов на основе фуллеренов для фотодинамической инактивации вирусов in vitro 121
5.1. Введение 121
5.2. Сродство фуллерена к вирусу 122
5.3. Фотодинамическая инактивация вирусов ^модифицированными фуллеренами в модельных водных системах 124
5.4. Особенности инактивации вирусов в реальных биологических жидкостях 130
5.5. Выводы 135
Выбор твердофазного фотосенсибилизатора на основе фуллеренов для фотодинамической инактивации вирусов биологических жидкостях 136 Выводы 140
Заключение 142
Литература 143
Приложение 1. Методическая часть к биологическим экспериментам по инактивации вирусов твердофазными фотосенсибилизаторами на
основе фуллеренов 155
Л. Приготовление вирус содержащей жидкости и определение степени се иифекционности 155
Б. Морфологические исследования (просвечивающая электронная микроскопия) 156
В. Изучение принципиальной возможности инактивации оболочечных вирусов фуллеренами в модельных системах 158
Г. Изучение динамики инактивации вирусов гриппа твердофазными фотосенсибилизаторами на основе фуллеренов 160 Приложение 2. Экспериментальное определение условий полной инактивации вирусов гриппа фуллереном, нанесенным на микрочастицы силикагеля, в аллантоисной жидкости куриного эмбриона 165
Приложение 3. Словарь специальных терминов 170
5
Введение
Исследование различных фотосенсибилизаторов и условий протекания фотосенсибилизируемых химических реакции является традиционным научным направлением, разрабатываемым в ГОИ им. С.И. Вавилова в течение нескольких десятилетий. Научная школа ГОИ в этой области знаний связана, в первую очередь, с именами таких академиков, как И.С. Вавилов и А.Н. Терснин.
Известно, что фотосенсибилизиация применяется в различных типах фотохимических реакций (фотоприсосдинение, фотополимеризация и др.), причем решение общей задачи нахождения оптимального фотосенсибилизатора невозможно. Наоборот, в каждом случае необходимо решать конкретную задачу, учитывающую тип фотохимической реакции, среду, в которой проходит соответствующая реакция, и предполагаемую область приложения реакции. В настоящей работе рассматривается вопрос использования фотосенсибилизатора Д1пгя возбуждения синглетного кислорода, который в настоящее время находит широкое применение, например, в лазерной технике - для возбуждения йода в газовых лазерах, а также в биологии и медицине - для окисления органических соединений.
Одним из актуальных применений реакции фотосенсибилизированного окисления органических соединений является метод фотодинамической инактивации болезнетворных организмов (вирусы, бактерии, простейшие и т.д.) в донорской крови и продуктах крови. В числе инфекционных агентов, контаминирующих кровь и препараты крови, достаточно упомянуть особо опасные вирусы иммунодефицита человека, гепатитов В и С, цитомегаловирус человека и др. [1, 2]. Роль этих агентов в структуре инфекционной патологии человека в последнее десятилетие возрастает в связи с изменением образа жизни, экологической обстановки и, кроме того, естественного процесса вирусной эволюции в человеческой популяции.
В настоящее время доноры, как и препараты крови, проходят многоступенчатый и дорогостоящий контроль на отсутствие вирусной контаминации. В связи с этим разработка доступных методик инактивации плазмы донорской крови и препаратов крови могла бы стать важным шагом к обеспечению безопасности процедуры гемотрансфузии. Обработка типа ультрафиолетового облучения вызывает повреждение терапевтических компонентов крови, поэтому для инактивации патогенов необходимы иные, более специфические, подходы.
Ранее было показано, что оболочечные вирусы могут быть эффективно инактивированы соединениями, производящими активные формы кислорода, среди которых красители являются наиболее заметным и широко используемым типом веществ. Способность к инактивации вирусов была описана для красителей различной химической природы, в частности, фталоцианинов, мероцианинов, производных порфирина, тиазинов, оксазинов, и некоторых других [3].
Благодаря преимущественному воздействию на вирусы, а не на компоненты биологической жидкости, метод фотодинамичсской инактивации вирусов, на наш взгляд, является оптимальным для целей очистки плазмы и препаратов плазмы крови. Однако, несмотря на все преимущества этого метода, использование фотосенсибилизаторов на основе красителей имеет ряд существенных недостатков, ограничивающих применение этого метода инактивации.
Недостаток, присущий большинству красителей - их растворимость в водных средах, которая приводит к загрязнению целевых продуктов инактивации следами используемого красителя. По нашему мнению, эта ситуация не отвечает современным требованиям, предъявляемым к лечебным препаратам, поскольку большинство красителей обладает свойствами цито- и генотоксично ста [4]. Дополнительным недостатком является низкая стабильность красителей при освещении, что может приводить к появлению продуктов фотодеструкции [5].
В связи с вышесказанным, при использовании таких водорастворимых красителей, остро стоит проблема удаления нежелательных и вредных примесей из биологических жидкостей после процесса фотодипамического воздействия. Это требует разработки методов селективной фильтрации таких веществ из вязких растворов, например плазмы, а, следовательно, разработки специальных фильтров, обеспечивающих полное удаление примесей [6]. Однако, учитывая масштабность потребности современной медицины в плазме донорской крови и белковых препаратах плазмы, создатгие и использование таких селективных фильтров неминуемо приведет к снижению объемов обрабатываемых целевых продуктов.
Проблематичность использования процесса инактивации плазмы и препаратов плазмы донорской крови с помощью красителей становится тем более очевидной при множественной трансфузии (в связи с неминуемым накоплением токсичных веществ у реципиента) и при очистке белковых препаратов из плазмы крови (в связи с проведением процесса в больших объемах, делающих нецелесообразным применение селективных фильтров).
Облегчить задачу применения метода фотодинамической инактивации вирусов в препаратах плазмы крови и плазме крови для множественной трансфузии позволит создание нового класса фотостабильных фотосенсибилизаторов твердофазного типа, обеспечивающих получение целевых продуктов, гарантированно свободных от вредных и нежелательных примесей.
Новые возможности для современных методов фотодинамической инактивации вирусов в плазме и препаратах плазмы крови открывает применение фуллеренов в качестве эффективных фотосенсибилизаторов для образования синглетного кислорода. В настоящее время фуллерены стали объектом активных исследований в различных областях науки и техники. Необычайные свойства этого класса соединений вызвали значительный интерес к их применению в качестве биологически и фармакологически активных веществ. Кроме того, твердофазные фотосенсибилизаторы на основе фуллерена
нерастворимы в воде и при необходимости могут быть легко удалены из водной среды.
Однако, получение твердофазной композиции, содержащей мономеры немодифицированного фуллерена, представляется достаточно сложной задачей. В свою очередь агрегация фуллерена в композиции может повлиять на эффективность генерации активных форм кислорода, в том тгисле синглетного кислорода. Дополнительная трудность проведения процесса сенсибилизированного окисления в водных средах состоит в коротком времени жизни синглетного кислорода в воде по сравнению с органическими растворителями и тем более с вакуумом. Благодаря этому обстоятельству исследователям ранее не удавалось зафиксировать образование синглетного кислорода в воде при участии высоко агрегированного фуллерена.
Высокая сенсибилизирующая способность твердофазного фотосенсибилизатора на основе фуллерена является только необходимым, но недостаточным условием проведения эффективного технологического процесса селективной инактивации вирусов. Помимо вопросов обеспечения сродства твердофазных фотосенсибилизаторов на основе фуллеренов к вирусу и их фотостабильности может возникнуть проблема, связанная с обеспечением высокой вероятности контакта фуллерена с кислородом и вирусом в водной среде, особенно в вязкой биологической жидкости, каковой является плазма крови.
Таким образом, настоящая работа посвящена созданию новых твердофазных фотосенсибилизаторов на основе фуллеренов, обладающих способностью генерировать синглетный кислород в водных средах, селективно воздействовать на вирусы и быть фотостабильными и легко извлекаемыми из биологических жидкостей после процедуры фотовоздсйствия.
Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов, заключения, списка литературы и трех приложений.
В первой главе представлен обзор литературы, посвященный вопросам возможности и особенностей применения фуллерена в качестве
9
сенсибилизирующего агента в фотодинамических процессах, в частности инактивации вирусов. На основе анализа литературных данных сформулированы основные задачи настоящей работы.
Во второй главе сформулированы основные требования, предъявляемые нами к твердофазным фуллеренсодержащим фотосенсибилизаторам, предназначенным для использования в установках по очистке плазмы и препаратов плазмы крови. На основании этих требований были предложены и изготовлены новые твердофазные фотосенсибилизаторы: раздробленный
кристаллический фуллерен; кластеры «аморфного» фуллерсна; пластины и микрочастицы, покрытые фуллерсном. Кроме того, во второй главе описаны процессы изготовления и результаты изучения структурных свойств этих сенсибилизаторов. По результатам исследований было показано, что во всех исследуемых композициях фуллерен находится в агрегированном виде, что может привести, в частности, к уменьшению эффективной концентрации фуллерсна и времени жизни триплстного состояния фуллерсна Кроме того, показано, что наилучшей среди исследованных композиций с точки зрения хорошей смачиваемости водными средами, простоты получения, воспроизводимости физико-химических свойств, технологичности практического использования в процессах инактивации вирусов и
извлекаемости фотосенсибилизаторов из биологической среды после процедуры фотодинамического воздействия, являются фуллерены, нанесешгые на микрочастицы силикагеля.
В третьей главе описаны результаты обнаружения синглетного кислорода, образованного при облучении твердофазных фуллереисодержащих фотосенсибилизаторов, помещенных в модельную водную среду, не содержащую электронодонорных соединений. Показано, что все исследуемые твердофазные фотосенсибилизаторы способны генерировать синглетный кислород. Обнаружено, что агрегация фуллерсна, присущая всем
разработанным композициям, способствует снижению эффективности
генерации синглетного кислорода. Несмотря на это, теоретически показано, что
10
сенсибилизирующей способности фуллерена, нанесенного на микрочастицы силикагеля, может быть достаточно для проведения эффективного технологического процесса инактивации вирусов в модельной водной среде, не содержащей электронодонорных соединений.
В четвертой главе приведены результаты исследования фотостабильности покрытий фуллерена на микрочастицах силикагеля (наиболее перспективного из разработанных твердофазных фотосенсибилизаторов) и на стеклянных пластинах по сравнению с эталонным фотосенсибилизатором (метиленовым синим). Была показана высокая фотостабилъность покрытий фуллерена Соо как в водной, так и в газовой среде, которая обуславливает перспективность их применения в фотодинамической терапии.
В пятой главе на основании исследований, проведенных совместно коллективами сотрудников Института лазерной физики ФГУП «НПК «ГОИ им.
С.И. Вавилова» (с участием автора) и НИИ Гриппа РАМН, продемонстрирована принципиальная возможность применения твердофазных фотосенсибилизаторов на основе фуллсренов для фотодинамической инактивации оболочечных вирусов in vitro. Показана инактивирующая способность полученных композиций в отношении оболочечных вирусов (на примере вирусов гриппа H0N1 и H1N1) в модельных водных средах в отсутствии электронодонорных соединений, а также в реальной биологической жидкости.
В первом приложении приведены методики проведения биологических экспериментов по инактивации вирусов гриппа.
Во втором приложении описан подбор условий получения полной инактивации вируса гриппа в аллантоисной жидкости куриного эмбриона с помощью твердофазного сенсибилизатора на основе фуллерена.
В третьем приложении представлен список специальных терминов.
Результаты работы прошли апробацию на следующих Между народных конференциях: 8th International Conference on Solar Energy and Applied Photochemistry “Solar - 05, Luxor, Egypt, 2005; 7th Biennial International Workshop
on Fullerenes and Atomic Clusters, St-Petersburg, Russia, 2005; IX Международная конференция ICHMS - 2005, Водородное материаловедение и химия углеродных наноматериалов, Севастополь, Крым, Украина, 2005; XII (XIII) Conference on Laser Optics, St.-Petersburg, Russia, 2006 (2008).
По теме диссертации опубликовано 5 работ в реферируемых журналах и сделано 8 докладов на Международных конференциях.
На защиту выносятся:
1. Способность агрегированных фуллеренов при их возбуждении видимым светом в водных средах генерировать синглетный кислород.
2. Твердофазный фотосенсибилизатор на основе фуллерена, при облучении видимым светом генерирующий синглетный кислород в водных средах.
3. Фотостабильность твердофазных фотосенсибилизаторов на основе фуллеренов в условиях облучения, характерных для процесса фотодинамической инактивации вирусов (длительность облучения < 2 ч., 100 мВт/см2, видимый диапазон спектра).
4. Фотодинамическая инактивация оболочечных вирусов в водных средах при использовании твердофазных фотосенсибилизаторов на основе фуллеренов.
12
Глава 1. Фуллерен и фотодинамическая инактивация вирусов
1.1. Фотосепсибилизируемые реакции
В фотохимии различают химическую и физическую фотосенсибилизацию [7, 8]. Суть химической сенсибилизации заключается в том, что возбужденные молекулы сенсибилизатора вступают в химическую реакцию с каким-либо реагентом, например растворителем, образуя при этом активную промежуточную частицу (чаще всего радикал). Затем в результате термических реакций эта промежуточная частица приводит к образованию продуктов и регенерации сенсибилизатора, т. с. при химической сенсибилизации не происходит образования возбужденных молекул реагентов. Примером такого процесса может служить сенсибилизированное бензофеноном фотоокисление спиртов.
Физическая сенсибилизация - перенос электронной энергии от возбужденной молекулы сенсибилизатора (донора) к невозбужденным молекулам реагента (акцептора). Поскольку молекулы в состояниях 8| (]Р*) и Т| (3Р*) могут вступать в разные реакции, возникает необходимость преимущественного заселения того или иного состояния с использованием процессов переноса энергии (тушения возбужденных состояний), т.е. осуществления фотосснсибилизированных процессов. В частности, в случае протекания процесса по схеме, приведенной ниже, (рис. 1.1) можно либо подавить образование продукта Рг, используя тушитель А с энергией
о
триплетного состояния меньше, чем у М*, или наоборот получить только этот продукт, используя фотосенсибилизатор Э с большей энергией триплетного состояния.
Фотосснсибилизация применяется в различных видах фотохимических реакций: при фотодиссоциации, фотоприсоединении, фотоокислении и т.д. [9].
13
ъ* I
Ьу А М -> 1М* —> 3М* -» М + А
4 4-
Н| 1*2
Рис. 1.1. Управление процессом с помощью сенсибилизаторов
14
1.2. Фотодинамическая терапия, активные формы кислорода
В настоящее время большой интерес для биологии и медицины представляют реакции фотосенсибилизированного окисления органических соединений активными формами кислорода (АФК), в частности синглетным кислородом 'С>2, супероксидным анион-радикалом 02'* и гидроксильный радикалом ОН* [5]. Этот процесс составляет основу фотодинамической терапии, которая может применяться для лечения онкологических, сердечнососудистых, офтальмологических, вирусных и микробных заболеваний [10-14]. Согласно современной классификации, фотодипамические реакции могут протекать по механизмам двух типов [15]:
к I типу относятся реакции, основанные на фотовосстановлсшш красителя при помощи окисляющих агентов, а молекулярный кислород играет роль акцептора электронов:
Р + Ьу -> *Р* -» 3Р* + В -» *Р' + Т>+ (1.1)
•р- + 02 -> Р + 02'*, (1.2)
где Р, 1Р*, 3Р* - молекулы фотосенсибилизатора в основном, возбужденном синглетном и триплетном состояниях, Э -окисляющий агент;
механизм II типа заключается в переносе энергии от фотосенсибилизатора в триплетном состоянии к молекулярному кислороду с заселением его синглетного состояния 1А(102), а затем синглстный кислород окисляет соответствующие субстраты [16]:
Р + Ьу -> 'Р* -> 3Р* + 02 -» '02 + Р (1.3)
'02 + 0^00х, (1.4)
где и - субстрат фотоокисления.
15
В реакциях I типа вследствие переноса водорода или электрона образуются свободные радикалы или супероксидные анионы, которые, также как и синглетный кислород, вызывают необратимое повреждение различных составных компонентов клетки, модификацию липидов, белков и нуклеиновых кислот. Кроме того, оба типа фотодинамических реакций протекают одновременно, конкурируя между собой в зависимости от относительной концентрации кислорода, фотоокисляемой молекулы и pH среды. Эндогенные доноры электронов (например, цистеин и глутатион) конкурируют как туши гели с молекулярным кислородом за возбужденное состояние сенсибилизатора. Поэтому реакции I типа, например, могут внести существенный вклад в фотодинамичсскис повреждения даже при низкой концентрации кислорода [15].
По мнению А.Л. Красновского мл. [17] вопрос о природе возбужденных состояний фотосенсибилизаторов, ответственных за фоторсакции типа 1, заслуживает отдельного обсуждения. Известно, что органические фогосенибилизаторы, в том числе и фуллерен, при фотовозбуждении образуют два наиболее долгоживущих возбужденных состояния: синглетное (*Р4) и триплетное (3Р*), соответствующие наиболее низколежащим электронным уровням этих соединений. Рассмотрим описание синглетных и триллетных электронных состояний таких фотосенсибилизаторов на примере молекулы фуллерена Сбо в интерпретации авторов [18] (рис. 1.2).
Каждое электронное состояние содержит большое количество колебательных подуровней. Так, состоянию Бо принадлежит основной уровень энергии и его колебательные подуровни. Электронный переход между основным состоянием и целой группой низко лежащих (примерно 1.9 - 2.5 эВ) возбужденных синглетных уровней запрещен по симметрии [19]. Эти электронные уровни вместе с их колебательными подуровнями образуют состояние Б] (1Р*). Однако обычно можно найти колебание подходящей симметрии, которое будет снимать запрет с электрошюго перехода. Таким образом, переходы между основным колебательным уровнем состояния
- Київ+380960830922