РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Відбір тварин для дослідження
Для вивчення дії хлориду кадмiю та солянокислого гiдразину на органiзм тварин використовували щурів трьох вікових періодів: 2,5-3-місячні тварини - період статевого дозрівання, коли спостерігається підвищення чутливості до шкідливих впливів, 6-8-місячних тварин (статево дозрілі тварини) та 18-24 місячних - старих тварини, в яких процеси катаболізму переважають над процесами анаболізму [135]. Досліди проведені на білих безпородних щурах-самцях, які утримувалися на стандартному раціоні віварію. В кожну експериментальну групу було включено 5-6 тварин. Iнтоксикацiю тварин кадмієм створювали шляхом триразового внутрішньошлункового введення хлориду кадмію в дозi 3,5 мг/кг маси тіла, що становить 1/25 LD50 з iнтервалом в одну добу. Розчин солянокислого гiдразину вводили одноразово внутрiшньоочеревинно з розрахунку 90 мг/кг маси тiла тварини на тлі кадмієвої інтоксикації (на восьму добу після першого введення кадмію).
З метою корекції метаболічних порушень через добу після кожного введення хлориду кадмію тварини одержували внутрішньошлунково: гістидин в дозі 2 мг/кг (концентрація гістидину в крові) та відповідно гістидинат міді (0,94 мг/кг) і гістидинат цинку (0,34 мг/кг). При цьому ми виходили із біотичних доз використаних металів - мікроелементів. Металокомплекси синтезовані на нашій кафедрі з гістидину та гідроксидів металів, взятих в еквімолярних концентраціях. Унітіол вводили через годину після ін'єкції солянокислого гідразину в дозі 100 мг/кг.
Матеріалами дослідження були плазма крові, сироватка крові, цільна кров та гомогенат печінки. Всі піддослідні тварини були поділені на такі групи: 1 - інтактні щурі; 2 - уражені хлоридом кадмію та солянокислим гідразином, 3, 4, 5, 6 - групи уражених тварин, в яких для корекції біохімічних порушень використовували відповідно: гістидин, гістидинати міді та цинку, унітіол. Тварин декапітували під ефірним наркозом на 1-у, 4-у, 7-у та 10-у доби з моменту введення солянокислого гідразину.
В процесі експерименту проводили спостереження за поведінкою тварин, кольором шерсті, поїданням кормів.
Експерименти на тваринах проводили у відповідності з "Правилами використання лабораторних експериментальних тварин".
2.2. Дослідження стану антиоксидантної системи
2.2.1. Визначення активності супероксиддисмутази.
Активність СОД визначали за відомим методом [177] у модифікації [158]. В основі методу знаходиться здатність ферменту інгібувати відновлення нітротетразолію синього. Для досліджень брали 1 мл 10 % гомогенату печінки, приготовленого на фосфатному буфері (рН 7,4). Попередньо досліджуваний матеріал обробляли хлороформ-спиртовою сумішшю і КН2РО4 з наступним центрифугуванням при 12000 об/хв протягом 15 хв при 4 ?С. До 0,2 мл супернатанту додавали 1,3 мл розчину з молярною концентрацією 0,1 моль/л фосфатного буферу (рН 8,3), 1 мл розчину нітротетразолію синього, 0,3 мл розчину феназинметасульфату і 2 мл розчину НАДН2 з молярною концентрацією 0,2 ммоль/л. Проби 10 хв витримували в темноті й фотометрували (СФ-46, 540 нм) в 1 см кюветі проти проб, до яких не додавали НАДН2. Контролем служили проби, в яких замість гомогенату знаходилося 0,2 мл фосфатного буферу.
Відсоток інгібування розраховували за формулою:
(Ек-Ед) 100/Ек,
де Ек ( екстинкція контрольної проби,
Ед ( екстинкція дослідної проби.
Кількість ферменту, яка здатна інігібувати відновлення нітротетразолію синього на 50 %, приймали за 1 ум. од. активності.
2.2.2. Визначення активності каталази.
Активність каталази визначали за методом [110]. Принцип методу грунтується на здатності пероксиду водню утворювати з молібдатом амонію стійкий забарвлений комплекс.
Каталазну активність визначали в плазмі крові і тканині печінки, з якої на холоді готували 10 % гомогенат на тріс-буфері з молярною концентрацією 0,05 моль/л (рН 7,8). Реакцію запускали додаванням 0,1 мл плазми або гомогенату до 2 мл 0,03 % розчину пероксиду водню. Паралельно готували холосту пробу, в яку замість досліджуваного матеріалу вносили 0,1 мл дистильованої води. Через 10 хв реакцію зупиняли додаванням 1 мл 4 % молібдату амонію. Інтенсивність забарвлення вимірювали на спектрофотометрі СФ- 46 при 410 нм проти контрольної проби, в яку замість пероксиду водню додавали 2 мл води.
Активність каталази виражали в каталах і розраховували за формулою:
А=(Ех-Ед)/(V?t?k),
де А ( активність каталази;
Ех і Ед ( екстинкція холостої і дослідної проб;
V- об'єм проби;
t( час інкубації (с);
k( коефіцієнт молярної екстинкції пероксиду водню, який дорівнює 22,2 ?103 М-1 см-1.
2.2.3. Визначення активності глутатіонпероксидази.
Активність ГП визначали за методом, описаним у роботі [83]. Метод оснований на здатності ферменту розщеплювати пероксид водню за допомогою відновленого глутатіону. До 0,3 мл плазми чи гомогенату печінки (1:4) додавали 0,5 мл тріс-буферу з молярною концентрацією 0,25 моль/л (рН 7,4), 0,1 мл розчину ЕДТА з молярною концентрацією 25 ммоль/л, 0,1 мл розчину азиду натрію з молярною концентрацією 0,4 моль/л. Суміш інкубували 5 хв при кімнатній температурі, після чого додавали 0,3 мл розчину відновленого глутатіону з молярною концентрацією 50 ммоль/л. Реакцію починали, додаючи 0,1 мл розчину Н2О2 з молярною концентрацією 50 ммоль/л. Через 1 хв реакцію зупиняли 1 мл 10 % розчину метафосфорної кислоти. Суміш центрифугували і в центрифугаті визначали кількість відновленого глутатіону [243]. Активність ферменту розраховували за різницею між кількістю відновленого глутатіону в контрольній (без Н2О2) і дослідній пробах і виражали в ммоль ГSH/ (хв? л (кг)).
2.2.4.Визначення активності глутатіонредуктази.
Активність ГР визначали за кількістю НАДФН2, що витрачається у ферментативній реакції відновлення окисненого глутат