РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
Експериментальна частина роботи виконана на 50-ти головах гусей оброшинської сірої породної групи, які вирощувались в умовах дослідного господарства "Оброшино" (с.Оброшино, Пустомитівського району, Львівської області) Інституту землеробства і біології тварин УААН. Дослідження проводились протягом 1999-2001 років в лабораторії фізіолого-біохімічних основ живлення птиці і лабораторії росту і розвитку вказаного інституту (з 25.06.2000 року - Інститут біології тварин УААН).
З метою дослідження онтогенетичних особливостей обміну білків у різних органах і тканинах гусей та субстратних механізмів їх регуляції було проведено дві серії дослідів.
2.1. Дослідження онтогенетичних особливостей обміну білків у різних органах і тканинах гусей
Перша серія дослідів була скерована на дослідження, з одного боку, вмісту білків, їх амінокислотного складу і співвідношення окремих білкових фракцій, вмісту сечової кислоти, активності аланін- і аспартатамінотрансфераз, кислих і нейтральних протеаз у печінці, грудному м'язі, шкірі, слизовій оболонці порожньої кишки 25-денних ембріонів, 1-, 10-, 30-, 60-денних гусей, а з другого - інтенсивності синтезу білків у вказаних органах і тканинах досліджуваної птиці в умовах in vitro при використанні в якості їх попередників мічених радіоактивним вуглецем лізину і глюкози в умовах in vitro. Крім цього, досліджували інтенсивність синтезу білків у вказаних органах і тканинах досліджуваних гусей в умовах in vitro при додаванні до інкубаційного середовища лізину, глюкози і пальмітинової кислоти у кількості: 1,7 мкмоль, 1,6 мкмоль і 1,1 мкмоль. В окремому досліді досліджували інтенсивність синтезу білків у печінці, скелетних м'язах, м'язовому шлуночку, стінці тонкого кишечнику і шкірі гусячих ембріонів у заключний період розвитку шляхом внутрішньом'язового введення їм 3-феніл-[1-14C]аланіну в 28-денному віці з наступним визначенням радіоактивності білків у цих органах і тканинах гусенят відразу після виведення.
Досліджувані гуси утримувались в умовах дослідного господарства "Оброшино" і одержували раціон концентратного типу, який забезпечував їх потребу в основних елементах живлення згідно норми [74].
Зразки досліджуваних органів і тканин одержували через 5-10 хвилин після забою птиці, який проводили шляхом декапітації, обмивали їх охолодженим фізіологічним розчином NaCl і підсушували фільтрувальним папером. Частину органів і тканин, в яких визначали вміст білків, і їх амінокислотний склад, співвідношення окремих білкових фракцій і вміст сечової кислоти заморожували в рідкому азоті і зберігали до початку аналізів. Іншу частину органів і тканин, які використовували для дослідження інтенсивності синтезу білків і активності ферментів, обмивали охолодженим фізіологічним розчином NaCl, підсушували їх фільтрувальним папером і до початку аналізів (10-15 хв) зберігали при 0?С.
2.1.1. Визначення загального вмісту білків в органах і тканинах гусей. У досліджуваних органах і тканинах визначали загальну кількість азоту за методом К'єльдаля, принцип якого базується на здатності органічних сполук під дією сірчаної кислоти в умовах кипіння окиснюватись до вуглекислоти і води. Азот білкових і близьких до них сполук при цьому відщеплюється і перетворюється в NH4+. Метод включає три етапи: мінералізацію (спалювання) тканини, відгонку аміаку і його визначення. Кількість аміаку, зв'язаного з сірчаною кислотою, визначають шляхом титрування 0,01н. розчином NaOH. Кількість загального білку визначають шляхом перемноження даних, одержаних при визначенні кількості аміаку на коефіцієнт 6,38 [76].
2.1.2. Визначення вмісту окремих фракцій білків в органах і тканинах гусей. Вміст окремих фракцій білків у досліджуваних органах і тканинах визначали методом електрофорезу в поліакриламідному гелі [75]. Перед розгонкою білків визначали кількість розчинних білків у тканинах за методом Лоурі [198]. Кількісна оцінка вмісту окремих білкових фракцій проводилась шляхом денситометрії із застосуванням приставки для сканування гелів "Gel-scanning". Площу піків окремих фракцій білків визначали після сканування гелів шляхом використання обчислювальної програми "Specord Demo".
2.1.3. Визначення вмісту окремих амінокислот у білках органів і тканин гусей. Амінокислотний склад білків досліджуваних органів і тканин гусей визначали на автоматичному аналізаторі амінокислот - ААА Т339, в основі дії якого покладено принцип іонообмінної хроматографії. Тканинні білки гідролізували 6н розчином соляної кислоти при температурі 110?С протягом 24-х годин [76].
Розділення суміші амінокислот проводили на хроматографічній колонці. Після детекції їх нінгідриновим реактивом визначали інтенсивність забарвлення при довжині хвилі 520 нм. Час виходу амінокислот і площа піку реєструвались на інтегреторі [93].
2.1.4. Визначення вмісту сечової кислоти в органах і тканинах гусей. Принцип методу полягає в тому, що сечова кислота розщеплюється ферментом уріказою з утворенням перекису водню, який, реагуючи з 3,5-дихлор-2-гідроксибензеносульфоновою кислотою за участю пероксидази, розпадається до води з утворенням забарвленого хінону [258]. Фотометрія проводилася на автоматичному апараті TECHNICON RA-1000 при довжині хвилі 510 нм. Кількість сечової кислоти виражали у мкмоль/ г тканини.
2.1.5. Визначення активності аспартатамінотрансферази і аланінамінотрансферази в органах і тканинах гусей. Активність вказаних ферментів визначали за допомогою набору реактивів "Аспартатамінотрансферази" і "Аланінамінотрансферази" фірми "Simko Ltd" [69, 109]. Принцип методу полягає в тому, що внаслідок переамінування, яке проходить при дії аспартатамінотрансферази, утворюється глутамінова і піровиноградна кислоти, а при дії аланінамінотрансферази - щавлева і піровиноградна кислота. При додаванні 2,4-динітрофенілгідразину в лужному середовищі утворюється забарвлений гідразон піровиноградної кислоти. Інтенсивність забарвлення визначали