ГЛАВА 2. ВЫДЕЛЕНИЕ И ФИТОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ИЗ
ЛИСТЬЕВ ВИНОГРАДА КУЛЬТУРНОГО
Объектом исследований были образцы листьев винограда культурного, заготовленные
после сбора урожая плодов на территории Палестины в 1999-2001 гг. Первым этапом
нашей работы было предварительное фитохимическое изучение листьев винограда
культурного сортов Дабуги, Шами и Бейрути на содержание разных классов
природных соединений. Наличие разных классов природных соединений
устанавливали, используя общепринятые реакции идентификации и методы
хроматографического анализа. Листья винограда культурного исследовали на
содержание углеводов, азотистых соединений, оксикоричных кислот, флавоноидов,
дубильных веществ, кумаринов, сапонинов, органических кислот, макро- и
микроэлементов.
2.1. Получение экстрактов для проведения качественных
реакций на некоторые классы природных соединений
Получение водных экстрактов. 50,0 г сухого сырья, измельченного до размера
частиц 2-3 мм, заливали 200 мл воды и нагревали с обратным холодильником на
кипящей водяной бане в течение 1 часа. Полученное извлечение фильтровали через
складчатый фильтр. Экстракцию сырья проводили дважды новыми порциями
растворителя. Объединенное извлечение концентрировали в вакууме до 50 мл и
использовали для обнаружения углеводов, аминокислот, дубильных веществ,
сапонинов.
Получение спиртоводных экстрактов. Экстракцию 50,0 г сырья проводили 50 %
этиловым спиртом аналогично методике, описанной выше. Полученное извлечение
концентрировали в вакууме до 100 мл, охлаждали и проводили очистку хлороформом
от липофильных веществ. Очищенное спиртоводное извлечение использовали для
обнаружения флавоноидов, оксикоричных кислот, сапонинов.
2.2. Подбор оптимальных условий экстракции для
извлечения биологически активных веществ
Для подбора оптимальных условий экстракции листья винограда культурного сорта
Дабуги, Шами и Бейрути экстрагировали 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 70 %, 80 %, 96 %
этиловым спиртом до истощения сырья, что проверяли хроматографически.
Для всех исследуемых сортов винограда оптимальным экстрагентом явился 50 %
этанол при соотношении сырье-экстрагент 1:10. Спиртоводные извлечения
хроматографировали в системе растворителей бутанол-уксусная кислота-вода (БУВ)
в соотношении 4:1:2. Схема хроматограммы спиртоводных извлечений листьев
винограда Дабуги, Шами, Бейрути представлена на рисунке 2.1.
Как видно из хроматограммы, наиболее богаты и сходны по химическому составу
листья винограда Дабуги и Шами. Листья винограда Бейрути отличаются несколько
иным и меньшим количеством БАВ.
2.3. Углеводы
Углеводы – это наиболее распространенная группа природных соединений, которая
может находится в растениях как в свободном, так и в связанном состоянии.
Рис. 2.1. Схема бумажной хроматограммы спиртоводных извлечений листьев
винограда Дабуги, Шами, Бейрути.
Система растворителей: бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:2)
2.3.1. Свободные сахара
Наличие свободных сахаров подтверждали реакцией Бертрана, которая заключается в
нагревании равных объемов водного экстракта листьев винограда изучаемых сортов
и реактива Фелинга [87]. Выпадение кирпично-красного осадка оксида меди
указывает на присутствие свободных сахаров.
Для идентификации свободных сахаров проводили дополнительную очистку водного
экстракта от полифенольных соединений. Для этого 20 мл экстракта пропускали
через колонку оксида алюминия (h = 4 см, d = 2 см). Элюат упаривали досуха,
растворяли в 1 мл 96 % спирта и использовали для хроматографирования на бумаге
в системе растворителей: н-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:2) и
н-бутанол-пиридин-вода (6:4:3) с достоверными образцами [78, 146, 159].
Высушенные хроматограммы обрабатывали анилин-фталатным реактивом (0,33 г
анилина, 1,66 г кислоты фталиевой в 100 мл н-бутанола насыщенного водой) и
нагревали в сушильном шкафу при температуре 80-1000С. В результате были
обнаружены глюкоза, галактоза, рамноза.
2.3.2. Связанные сахара
Гликозиды. Качественное определение сахарных компонентов проводили с помощью
реакции с реактивом Фелинга и 20 % спиртовым раствором a-нафтола [86, 87].
После гидролиза водных экстрактов 5 % раствором серной кислоты объем полученных
осадков с реактивом Фелинга был гораздо больше, чем до гидролиза. Из этого
можно сделать вывод о наличии сахаров в связанном состоянии.
Положительная реакция с 20 % спиртовым раствором a-нафтола и концентрированной
серной кислотой (образование красно-вишневого кольца) подтверждает наличие
гликозидов.
Полисахариды. К 20 мл водного экстракта добавляли четырехкратный объем 96 %
этанола. При этом выпадал рыхлый хлопьевидный осадок, который отделяли,
промывали эфиром и высушивали. Из 0,1 г осадка готовили 2% раствор для
проведения реакции с реактивом Фелинга и 5 % раствором сульфата меди [85, 142,
148].
Выпадение кирпично-красного осадка свидетельствует о наличии полисахаридов.
2.4. Полисахариды
2.4.1. Изучение мономерного состава полисахаридов
Выделение углеводов из листьев исследуемых сортов винограда культурного
проводили по единой схеме. Высушенное и измельченное сырье, предварительно
обезжиренное хлористым метиленом, последовательно экстрагировали разными
растворителями: 82% этанолом – получали спирторастворимые сахара (СР); водой –
водорастворимые полисахариды (ВРПС); смесью 0,5 % растворов щавелевой кислоты и
оксалата аммония – пектиновые вещества (ПВ); 7 % раствором едкого калия –
гемицеллюлозу (ГЦ). ВРПС и ПР очищали от белков методом Севага и
фракционировали, используя метанол. ГЦ нейтрализовали уксусной кислотой и также
фракционир
- Київ+380960830922