РОЗДІЛ 2
ОБ'ЄКТИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Об'єкти дослідження
За основний об'єкт дослідження були обрані клітини зон меристеми, розтягу та диференціювання головного кореня 2-добових проростків крес-салату (Lepidium sativum L.). Апекси коренів покритонасінних рослин є зручним об'єктом для цитологічних досліджень внаслідок стабільності та чіткості топографії меристематичних клітин та похідних з них клітин різного типу в зонах розтягу та диференціювання.
2.2. Методи культивування
При підборі оптимальних умов вирощування крес-салату на кліностаті необхідно було дотримуватися основних вимог, а саме: густина середовища не повинна перешкоджати росту корінців і, водночас, вона має бути достатньою для того, щоб передавати момент руху від вісі кліностату на корінці, тобто, щоб проростки не плавали в середовищі, а були закріплені в ньому. Остаточно, насіння крес-салату в асептичних умовах поміщали у середовище, що містило 1%-ий розчин агару у дистильованій воді. Посів насінин провадили у ламінарному боксі. Під час висіву насінини орієнтували зародковим коренем донизу. Проростки росли в пробірках діаметром 30 мм та висотою 100 мм у темряві протягом двох діб. Для вирощування рослинних об'єктів в умовах кліностатування нами були використані горизонтальні кліностати, яки повільно обертаються (2 об/хв.). Оскільки кліностат обертається в гравітаційному полі, кліностатування, очевидно, не усуває та не змінює сили тяжіння ані скалярно, ані векторно, тому кліностатування лише частково відтворює біологічні ефекти мікрогравітації. Обертання біологічного зразка на горизонтальному кліностаті з відповідною швидкістю тільки забезпечує безперервну реорієнтацію об'єкта по відношенню до гравітаційного вектору, що перешкоджає сприйняттю рослиною гравітаційного стимулу або реалізації наступної відповіді [130, 149, 172].
Не зважаючи на ці обмеження, кліностати широко використовуються, щоб дослідити ефекти зміненої гравітації, оскільки вони роблять можливим проводити експерименти в необхідних часових діапазонах та використовувати більшу кількість аналітичних методів, які еквівалентні завданням експериментів, порівняно з умовами космічного польоту [148].
При вивченні подразнення силою тяжіння або відцентровою силою необхідно враховувати існування двох величин подразнення: сумарної (gt) та порогової (g) [25]. Для отримання ефекту подразнення сила подразника повинна бути не меншою за визначену порогову величину. Ймовірна порогова величина подразнення для коренів складає біля 10-3 - 10-4 g [256]. Зі збільшенням радіусу обертання зростає відцентрова сила, тому радіус обертання об'єкту намагаються звести до нуля. Відцентрову силу (С) розраховували за формулою:
C = 4?2r / t2,
де r - відстань від осі ротору до об'єкта, м;
t - час, протягом якого ротор кліностату здійснює один оберт, с. Співвідношення між відцентровою силою та силою тяжіння розраховували за формулою:
C/g = 4?2r / gt2 = 4,024r/t2.
Відцентрова сила при обертанні культуральної посудини в залежності від положення об'єкту по відношенню до осі обертання становить:
C = 4?2?15 ?10-3g / 302?9,81 = 6,7?10-5g;
C = 4?2?0 ?g / 302?9,81 = 0.
Отже при швидкості обертання 2 оберти за хвилину та радіусі посудини 15 мм, С= 0 - 6,7?10-5.
2.3. Світлова мікроскопія
2.3.1. Приготування давлених препаратів для цитохімічних досліджень.
Корені довжиною 8 - 10 мм фіксували сумішю Карнуа за стандартною методикою. Фіксований матеріал проводили крізь серію спиртів та мацерували при кімнатній температурі в 5н. соляній кислоті. Корені під бінокуляром лезом розділяли на зони меристеми, розтягу та диференціювання та роздавлювали в 45%-вій оцтовій кислоті.
2.3.2. Приготування давлених препаратів для імуноцитохімічних досліджень.
Відділені від коренів меристеми фіксували у суміші 4%-ого параформальдегіду у фосфатному буфері, рН 7,5, з 5мM MgSO4 та 10мM етиленгліколь-віс (?-аміноетиловий ефір) N, N, N', N' - тетраоцтової кислоти (ЕГТА) протягом 2 годин під вакуумом. Після фіксації меристеми оброблювали 0,5%-им розчином борогидриду натрію та 40мМ розчином гліцину. Борогидрид натрію та гліцин є речовинами, що блокують альдегідні групи в клітині і тим самим зменшують рівень аутофлюоресценціі. Меристеми мацерували у "коктейлі" ферментів, що складався з 2%-ої целюлази, 1%-ої пептінази, 0,5%-ого мацерозиму та 0,4M манітолу у PBS, при 370С. Потім меристеми розміщували на оброблених аптесом предметних скельцях та роздавлювали. Препарати зберігали при -200С до наступної обробки.
2.3.3. Приготування препаратів напівтонких зрізів меристем, заключених в смолу LRWhite.
Корені крес-салату фіксували сумішю 4%-ого формальдегіду та 0,5%-ого глютаральдегіду у фосфатному буфері, рН 7,2 протягом 2 годин при кімнатній температурі. Під час промивання у буфері, під бінокуляром лезом відділяли меристему коренів, яка і являла собою об'єкт подальших досліджень. Меристеми дегідратували в етанолі зростаючої концентрації та інфільтрували в акриловій смолі LRWhite при +40С. Після закінчення інфільтрації, меристеми розкладали по капсулах, заливали чистою смолою LRWhite та витримували у термошафі при +610С протягом 23 годин для полімеризації. Для світлооптичних досліджень напівтонкі зрізи меристем товщиною 2 мкм монтували на предметних скельцях, покритих аптесом.
2.3.4. Приготування препаратів напівтонких зрізів меристем, заключених в смолу Immuno-Bed.
Корені крес-салату фіксували сумішю 4%-ого формальдегіду та 0,5%-ого глютаральдегіду у фосфатному буфері, рН 7,2 протягом 2 годин при кімнатній температурі. Під час промивання у буфері, під бінокуляром лезом відділяли меристему коренів, яка і являла собою об'єкт подальших досліджень. Меристеми оброблювали 0,5%-им розчином борогидриду натрію та 40мM розчином гліцину. Дегідратацію проводили в етанолі зростаючої концентрації при +40С. Меристеми інфільтрували в суміші компоненту А смоли Immuno-B