РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Матеріали дослідження.
Об’єктом дослідження були 119 культур моноцитів периферійної крові практично
здорових донорів-чоловіків віком 20-24 років. Забір крові в обсязі 20 мл
проводили з кубітальної вени в ранкові години (8.00-9.00) до їжі. Кров вносили
до стерильних скляних пробірок, які містили 0,2 мл гепарину, перемішували та
для отримання плазми відстоювали протягом 2 год в термостаті при 37 ? С.
Отримана плазма крові в подальшому використовувалась для виділення моноцитів.
Донори, кров яких використовувалась для проведення експериментів, були ретельно
обстежені з метою виключення наявності гострих та хронічних інфекційних й
соматичних захворювань, стресу безпосередньо перед забором крові [66]. У всіх
донорів бралась кров для визначення загальної кількості лейкоцитів та
відсоткового вмісту моноцитів.
Пептидоглікани та тейхоєві кислоти грампозитивних коків отримували з культур
мікроорганізмів, виділених від 139 хворих на гнійно-запальні захворювання, які
находились на стаціонарному лікуванні в травматологічному відділенні Луганської
обласної клінічної лікарні з 1992 р. по 2000 р. Встановлення родової
приналежності культур та видову ідентифікацію стафілококів проводили згідно з
наказом Міністерства охорони здоров'я СРСР № 535 від 22 квітня 1985 р. «Про
уніфікацію мікробіологічних (бактеріологічних) методів дослідження, які
застосовуються в клініко-діагностичних лабораторіях лікувально-профілактичних
установ» та “Визначника бактерій Берджі” [63]. Ідентифікацію бактерій роду
Staphylococcus проводили за допомогою культурального (дослідження колоній на
щільному середовищі, наявність зони гемолізу), бактеріоскопічного (фарбування
мазків за Грамом) і біохімічного методів (ферментація глюкози в анаеробних
умовах, наявність лецетинази, плазмокоагулази, ДНКази, фосфатази).
Встановлення приналежності виділених культур до роду Streptococcus і
ідентифікацію стрептококів проводили за допомогою культурального (за видом
гемолізу на кров'яному агарі), бактеріоскопічного (фарбування мазків за Грамом)
і біохімічного методів (наявність протеази).
Для культивування анаеробних неспороутворюючих бактерій використовували
анаеростат, заповнений трикомпонентною газовою сумішшю (азот -80 %, водень - 10
%, вуглекислота - 10 %). Посів на анаеробну мікрофлору робився негайно протягом
не більш як двох годин з моменту забору. Засів патологічного матеріалу
проводили на свіжовиготовлене щільне середовище з кров’ю та одним з
антибіотиків (канаміцин, гентаміцин, налідиксова кислота); збагачене напіврідке
тіогліколеве середовище. Для ідентифікації анаеробних збудників на IV етапі
лабораторного дослідження (6-й - 7-й день) використовували культури анаеробних
бактерій, які виросли на твердих та напіврідкому накопичувальному середовищі.
Досліджувані культури ідентифікували до роду та виду за результатами вивчення
культуральних, морфологічних, біохімічних властивостей та чутливості до
антибіотиків з урахуванням даних “Методичних рекомендацій по мікробіологічній
діагностиці захворювань, викликаних неспороутворюючими анаеробними бактеріями”
(М., 1986).
Для ідентифікації виділених бактерій використовувалися також комерційні
тест-системи Мікро-Ла-Тест продукції АТ «Лахема»Т (Чехія). Ідентифікацію
анаеробних бактерій проводили за допомогою призначеної для цього системи API 20
A Ref. 20300 (виробництва фірми bioMerieuxТ (Франція)) [17].
2.2. Методи дослідження.
Виділення моноцитів з периферичної крові донорів здійснювали за методикою Boyum
[58] в градієнті щільності фікол-верографін. З 76 % верографіну готували 14,3 %
робочий розчин: до 20 мл ампульного верографіну добавляли 86,2 мл
бідистильованої води і 0,1 мл 0,1 н розчину NaOH. Щільність виготовленого
розчину (1,077 г/мл) перевіряли ареометром. Нашаровували 4 мл гепаринізованої
венозної крові, розведеної 1:1 забуференим фосфатним буфером ізотонічним
розчином натрію хлорид, при рН=7,2, на поверхню розчину верографіну (4 мл) і
негайно центрифугували при 1500 об/хв протягом 40 хв. Вміст пробірки розділявся
на 4 прошарки (зверху вниз): плазма, кільце мононуклеарних клітин, верографін,
еритроцитарна маса. Кільце мононуклеарів і верхній прошарок верографіну
відсмоктували пастерівською піпеткою. Мононуклеари тричі відмивали від
верографіну при 1000 об/хв по 10 хв. Якщо спостерігалася домішка еритроцитів,
їх руйнували 0,83 % розчином амонію хлорид на трис-буфері, рН=7,65. Моноцити
відокремлювали від лімфоцитів в полістиролових чашках Петрі шляхом використання
спроможності моноцитів прилипати до дна чашки при інкубації з повітрям, яке
містило 5 % СО2 при 37 ? С протягом 1 год. Неприлиплі клітини видаляли
аспірацією. В чашки Петрі з моноцитами, які залишились, вносили розчин Версену
в середовищі 199, витримували протягом 30 хв при 37 ? С, після чого клітинну
визвесь тричі відмивали від середовища Версену при 1000 об/хв по 10 хв.
Моноцити ідентифікували шляхом фарбування за Романовським-Гімзою. Відсоток
моноцитів складав 94, життєздатність складала 98 %. З отриманої визвесі
моноцитів готували робочу концентрацію 106 клітин/мл.
Пептидоглікани одержували з клітинних стінок бактерій за методом Peterson P.K.
et al. [201]. Культури грампозитивних умовно-патогенних бактерій вирощували в
середовищі, яке містило пептонний дріжджовий екстракт (0,5 % екстракт дріжджів,
1,3 ммоль К2НРО4, 1,1 ммоль глюкози, рН=7,2-7,4) та інкубували при 37 ? С
протягом 2-4 год. Бактерії логарифмічної фази інокулювали в 10 л вищевказаного
середовища та інкубували при 37 ? С протягом 24 год зі струшуванням. Бактерії
отримували центрифугуванням (5000 g, 4 ? С, 10 хв) та
- Київ+380960830922