РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Дослідження виконані в лабораторії фізіології та біохімії Інституту свинарства ім. О.В.Квасницького Української академії аграрних наук та агрокомбінаті по виробництву свинини "Калита" Броварського району, Київської області.
В дослідах використано 63 нормально розвинені свинки великої білої породи - аналоги за віком ( 8-9 місяців) та живою масою (125 - 130 кг.). Утримання тварин групове (по 10 - 11 голів у станку), безвигульне. Свиноматкам згодовували комбікорм СК-4 згідно норм годівлі ІСв УААН з урахуванням їх фізіологічного стану та прийнятої технології годівлі свиней.
Охоту у свиноматок визначали з допомогою кнура - пробника один раз на добу (о 7 годині ранку ) за появою у них рефлексу нерухомості. Початком охоти вважали час між двома визначеннями: коли в передостанній раз прояв рефлексу нерухомості був відсутнім, а в останній - присутнім.
Штучне осімінення свинок проводили через 24-30 годин від початку охоти, користуючись приладом УКП - 1.
Частину тварин ( 40 голів ) було забито в різні періоди статевого циклу та поросності, 5 - залишено до опоросу (тривалість поросності складала 114 -115 днів), а 18 - вилучено з досліду за виробничих причин.
Забій свиноматок проводили в такі періоди відтворювального циклу: статевий спокій (10-а доба після встановлення рефлексу нерухомості), охота (через 24 години після її початку), на 10-у, 15-у, 20-у, 30-у, 60-у та 90-у добу поросності - по 5 голів в кожній групі (табл. 2.1). Годівлю свиноматок припиняли за 8 - 14 годин до забою.
Негайно після забою від свиноматок терміново відбирали печінку та статевий апарат, які розміщували на спеціальному столику з постійним охолодженням рідким азотом.
Таблиця 2.1.
Схема досліджень по вивченню динаміки процесів ПОЛ-АОЗ в тканинах свиноматок і плодів.
Періоди відтворювального циклуКількість свинок у групіДосліджуваніоргани і тканинипоказникиСтатевий спокій5Печінка свиноматки.
Ендометрій і міометрій: основа, середина та верхівка рогу матки.Дієнові кон'югати
(Стальная И.Д., 1977);
малоновий діальдегід
(Владимиров Ю.А., Арчаков А.И, 1972);
відновлений глутатіон
(Ellman G.L., 1959);
ксантиноксидаза,
(Westerfeld W.W, 1950)
каталаза,
(О.Г.Архипова, 1988);
глутатіонпероксидаза
(Kraus P., Gross B, 1979);
глутатіонтрансфераза
(Maged Y., Siegers S., 1984).Охота5Доби поросності:10-а5Печінка свиноматки.
Ендометрій і міометрій: основа, середина та верхівка рогу матки.15-а520-а530-а5Печінка свиноматки.
Ендометрій і міометрій: основа, середина та верхівка рогу матки та зони вільні від плодових оболонок.60-а5Печінка свиноматки та плода (великого, середнього і малого)
Найдовший м'яз спини плода (великого, середнього і малого)
Плодові оболонки (великого, середнього і малого) плода.
Ендометрій і міометрій в зонах розміщення живих плодів (великого, середнього і малого).
Ендометрій і міометрій в ділянках вільних від плодових оболонок.
Ендометрій і міометрій в зонах розміщення загиблих плодів.90-а5115-а (опорос)5Печінка та найдовший м'яз спини новонародженого поросяти (великого, середнього та малого).
Проводили визначення морфометричних параметрів статевого апарату та плодів у піддослідних свинок, підраховували кількість жовтих тіл, фолікулів та ембріонів, масу та лінійні розміри плодів [82]. Згідно зі схемою досліджень, швидко відбирали зразки тканин з окремих ділянок печінки (лівої латеральної долі) свиноматок, слизової та м'язової оболонок матки: (у циклюючих та в ранні строки поросності - з верхівки, середини та основи рогів на 60-у і 90-у доби - з ділянок розташування плодів (великого, середнього, малого) та між ними; з плодових оболонок, печінки та найдовшого м'яза спини 60-и і 90-денних плодів; печінки та найдовшого м'яза спини новонароджених поросят [86]. Зразки відібраних тканин розміщували у спеціальних поліетиленових гільзах, які занурювали у судини Дьюара з рідким азотом, де вони зберігалися до подальших досліджень.
У відібраних тканинах визначали активність ксантиноксидази (як одного з можливих джерел утворення супероксидного аніонрадикалу, який вона сама і знешкоджує, перетворюючи в пероксид водню) за зростанням рівня сечової кислоти (максимум поглинання при 290 нм, опалесценція розчину при 330 нм, молекулярний коефіцієнт екстинкції 0,0125 1/М?см) в зразку після 30-хвилинної інкубації розчину ксантину з біологічним матеріалом. Результати виражали в нкатал/сек•кг [306 ].
Для оцінки рівня вільнорадикального ПОЛ в досліджуваних тканинах визначали концентрацію первинних продуктів пероксидації - дієнових кон'югатів (ДК), в процесі центрифугування гомогенату тканини з екстрагуючою сумішшю гептану та ізопропанолу (1:1)[185]. Відібрану гептанову фазу розбавляли етанолом (1:5) та проводили визначення спектрофотометричним методом при максимумі поглинання (довжині хвилі) - 233 нм (молярний коефіцієнт екстинкції 22000 1/М?см).
Концентрацію вторинних, ТБК - реагуючих, продуктів, до яких належить малоновий діальдегід (МДА), визначали за реакцією їх з тіобарбітуровою кислотою (ТБК) в процесі 1,5 - годинної інкубації проб в залізо-аскорбатному буфері, вираховували кількість МДА до та після інкубації (нмоль/г), а також приріст за період інкубації (в %) [37].
Для оцінки рівня АОЗ проводили визначення активності каталази за кількістю розщепленого пероксиду водню, що розпався в дослідній пробі за одиницю часу. Кількість пероксиду водню, що залишився, визначали титруванням його 0,1N розчином перманганату калію у кислому середовищі. За одиницю активності брали мкмоль Н2О2/хв?г[127].
Активність глутатіонтрансферази визначали за зменшенням кількості відновленого глутатіону при кон'югації його з 1-хлор-2,4-динітробензолом, до якого специфічна одна з ізоформ ферменту [279]. Про активність глютатіонпероксидази висновували за зниженням концентрації відновленого глутатіону в процесі інкубації біологічного матеріалу з перок