РОЗДІЛ 2
ЗАГАЛЬНА МЕТОДИКА І ОСНОВНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Загальна методика та об'єкти дослідження
У відповідності з метою та задачами дослідження нами був проведений експеримент на 110 білих трьохмісячних щурах-самцях з початковою масою тіла 190-215 г. Тварини протягом двох тижнів перед початком експерименту знаходились в умовах карантину, після чого були розділені на дві групи: 1 група - інтактні тварини, які утримувались в звичайних умовах віварію; 2 група - щурі, яким проводили холодову деструкцію шкіри, площею 9-10 % поверхні тіла та глибиною відповідно опіку шкіри III А-Б ступеня (табл. 2.1).
Таблиця 2.1
Розподіл тварин за групами та методами досліджень.
ГрупаСвітлова мікроскопія Електронна мікроскопіяКонтроль4015Кріодеструкція4015 Протягом всього експерименту усі щури утримувались в умовах віварію згідно з "Правилами проведення робіт з використанням експериментальних тварин". За тваринами здійснювали систематичний нагляд та догляд. Годування проводилось два рази на добу. Воду не обмежували. В приміщенні, де утримувались лабораторні тварини температура постійно підтримувалась на рівні 24-25 ?С.
Після попереднього внутрішньочеревного наркозу тіопенталом натрію (з розрахунку 30-40 мг на 100 г маси тіла), тварин контрольної та експериментальної груп виводили з експерименту шляхом декапітації через одну, три, сім, чотирнадцять та двадцять вісім діб після нанесення холодової травми шкіри. Для подальшого морфологічного дослідження були обрані легені щурів.
2.2. Моделювання кріодеструкції шкіри
Після попереднього внутрішньочеревного наркозу тіопенталом натрію (з розрахунку 25 мг/кг маси тіла), за допомогою безпечної бритви проводили депіляцію шкіри спини та лівого боку лабораторних тварин. При виході щурів із наркозу холодову деструкцію шкіри здійснювали шляхом прикладання до неї на шість секунд двох мідних пластин (площею 14,5 см2 кожна), які попередньо довгий час знаходились в рідкому азоті (t= -196 ?С) (рис. 2.1). При цьому площа ушкодження склала 9-10 % поверхні тіла, а глибина відповідала опіку III А-Б ступеню (рис. 2.2) [28].
Рис. 2.1. Зовнішній вигляд рани у щура через 7 діб після кріодеструк-
ції шкіри.
Рис. 2.2. Деструктивні та дистрофічні зміни в шкірі щурів через добу
після її кріодеструкції. Фарбування гематоксилін-еозином.
х100.
2.3. Макрометричні методи дослідження
Масу тварин визначали за допомогою чашкової ваги з точністю до 1 г. Абсолютну масу легень визначали на торсіоних техніко-хімічних терезах I-го класу типу Т-200, з граничним навантаженням 200 г та з точністю при 10 % навантаженні ±25 мг.
Відносну масу легень розраховували за формулою:
Мвідн = абсолютна маса органа (мг) / маса тіла (г).
Об'єм легень визначали за допомогою мірної колби (см3), яка була заповнена водою (ціна поділки складала 0,2 мл).
Щільність тканини легень розраховували як відношення маси легень до їх об'єму (мг/см3).
2.4. Гістологічні методи дослідження
Для гістологічного дослідження в усіх випадках брали праву легеню щурів. Вибір саме цієї легені був обумовлений можливістю в момент постановки експерименту прямого впливу холоду на ліву легеню, оскільки кріодеструкцію шкіри проводили саме з лівого боку.
Шматочки тканини (товщиною не більше 0,5 см) фіксували в 10 % розчині нейтрального формаліну. Після фіксації матеріал промивали, зневоднювали в батареї спиртів зростаючої концентрації, проводили через хлороформ та заливали в парафін [19]. На ротаційному мікротомі готували зрізи товщиною 7-8 мкм, які потім фарбували гематоксилін-еозином та вміщували на склі в канадський бальзам.
Гістологічне дослідження паренхіми легень здійснювали на мікроскопі Laborlux S (Leitz) при збільшеннях: 10/0,25х10, 40/0,65х10 і 100/1,25х10.
2.5. Ультраструктурні методи дослідження
Під глибоким тіопенталовим внутрішньочеревним наркозом проводили трахеотомію. Після двосторонніх розрізів по міжреберним проміжкам легені спадалися, після чого в трахею зразу ж вводили приблизно 1,5 мл 2,5 % розчину глютарового альдегіду на фосфатному буфері. Після розтину грудної порожнини in situ праву легеню продовжували на протязі 15-20 хвилин поливати 2,5 % розчином глютарового альдегіду. Шматочки легені вирізали лезом, розрізали на невеликі блоки та продовжували фіксувати в тому ж розчині протягом години. Потім матеріал проводили в 1 % розчині чотирьохокису осмію на фосфатному буфері, 1 % розчині танінової кислоти, зневоднювали в батареї спиртів зростаючої концентрації та ацетоні, проводили в сумішах ацетону та епону і заливали в капсулах чистим епоном [218].
Напівтонкі та ультратонкі зрізи готували на ультрамікротомі LKB-3 (Швеція). Напівтонкі зрізи розташовували на предметному склі та фарбували 1 % розчином метиленового синього. Ультратонкі зрізи вкладали на мідні опорні сіточки та контрастували уранілацетатом та цитратом свинцю за Рейнольдсом [218]. Фотографування проводили на електронних мікроскопах Hitachi-9А та Hitachi-12А (Японія).
2.6. Методи мікроморфометрії і математичного аналізу
Тканинний гістометричний та стереологічний аналізи проводили на
демонстраційному екрані мікроскопа Laborlux S (Leitz) при збільшенні 40/1,25х10.
Гістометричний аналіз проводили на демонстраційному екрані за допомогою штангенциркуля на продольних січеннях альвеол. Він включав в себе визначення ширини та глибини альвеол, а також товщини міжальвеолярної перегородки з її вужчого і ширшого країв та в середній частині, після чого визначали середнє значення товщини міжальвеолярної перегородки. Глибина альвеоли вимірювалась від площини входу до самої глибокої точки куполу альвеоли.