Розділ 2
Власні дослідження
2.1. Матеріали та методи досліджень.
Дисертаційна робота виконана впродовж 1999-2002 років в лабораторії вивчення хвороб рогатої худоби Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН.
Мінливість біологічних і антигенних властивостей культур B.ovis вивчали на 15 штамах, які тривалий час (більше 10 років) підтримувались на бруцельозних живильних середовищах і зберігались в музеї лабораторії вивчення хвороб рогатої худоби ІЕКВМ з періодичним (через 1-1,5 місяці) пересівом. Характеристику штамів визначали згідно методик, рекомендованих ФАО/ВОЗ (1986) та МЕБ (2000).
Морфологічні і тинкторіальні властивості культур B.ovis досліджували під імерсійною системою мікроскопу (?90) у мазках пофарбованих за методами Грама, Стемпа та Козловського. Стабільність штамів і характеристику колоній вивчали на 3-4 добових культурах висіяних на чашки Петрі з бруцельозними середовищами під стереоскопічним мікроскопом МБС-2 при боковому освітлені знизу за модифікованою П.М. Жованіком методикою [136]. З метою визначення ступеня дисоціації популяції штамів, чотирьохдобову культуру на чашках Петрі фарбували за методом Уайт-Вілсона 0,05 % розчином кристал-віолету протягом 30 секунд. Біологічні властивості визначали по наступним показникам: продукція сірководню (H2S), ріст на середовищах з основним фуксином (1:50000) і тіоніном (1:50000), аглютинація з розчином трипафлавіну, термоаглютинація суспензії бактерій. Антигенні властивості досліджували в пластинчатій реакції аглютинації (РА) із бруцельозними S- та R- бруцельозними сироватками виробництва НВО "Рівес", Росія. Постановку РА на скельцях з живими культурами проводили за загально прийнятою методикою з візуальним обліком при косому освітленні знизу від освітлювача ОІ-19 або під великим збільшенням стереоскопічного мікроскопу МБС-2 із додержанням правил безпеки.
З метою визначення морфологічних характеристик B.ovis для диференційної мікроскопії від хламідій 7-добові курячі ембріони заражали вакцинним штамом B.ovis 67/Б. Суспензію бактерій вводили в жовтковий міхур з наступним контролем загибелі та реізоляцією заражуючої культури із умісту жовткового міхура та алантоїсної рідини на МППГГА та МППГГБ. Морфологію бактерій досліджували мікроскопією мазків-відбитків пофарбованих за Грамом і Стемпом.
Розрахунок 50 % летальної дози проводили за методом Ріда й Менча за формулою:
lg LD50 = lg B + (b - 50 / b - a) ? d, де
B - доза з ефектом більше 50 %;
b - ефект дози В в %;
а - ефект дози А в % (А - доза з ефектом менше 50 %);
d - інтервал поміж log двох сусідніх розведень.
Родо- та видоспецифічні антигенні властивості штамів B.ovis визначали в пластинчатій реакції аглютинації на предметних скельцях з антисироватками, одержаними в лабораторії вивчення хвороб рогатої худоби (А.Ф. Бабкін, М.Г. Галіщев, С.М. Орлов, С.В. Меліхов, 1998-2000) на штами B.ovis 67/Б, 76/982, 156/7807, які у попередніх спостереженнях мали суттєву антигенну варіабельність. Для імунізації використали 10 клінічно здорових кролів вагою 2,5 кг, яким уводили специфічні бактерини B.ovis за розробленими схемами. Гіперімунні сироватки досліджували зі стандартними S- та R-бруцельозними антигенами та 3-4 добовими агаровими культурами бруцел в S-, R- та RS-формах із визначенням граничного та робочого (2 - 3-х кратний відносно граничного) титрів сироваток. В роботі було використано 5 штамів B.abortus (3/544, 10/19-770, 88/7-26, 93/В-8, 174/В-1), 1 штам B.melitensis (Rev-1a), 3 штами B.suis (152/11-2, 171/0184, 172/112) та 15 штамів B.ovis (65/65939, 67/Б, 76/982, 78/3131, 154/8206, 155/8162, 156/7807, 157/4151, 158/04496, 159/8406, 162/08337, 166/13575, 168/1806, 169/87, 175/1257).
Географічне походження використаних штамів:
B.abortus 3/544 - Міжнародний референтний штам, одержаний із Одеського НДІ ім. І.І. Мечнікова у 1966 році (спонтанний дисоціант ІЕКВМ);
B.abortus 10/19-770 - вакцинний, ізольований із виробничої серії вакцини з штаму 19, серія 770 у 1961 році в УНДІЕВ;
B.abortus 88/7-26 - інаглютиногенний мутант, виділений П.М. Жованіком у 1963 році в УНДІЕВ;
B.abortus 93/В-8 - інаглютиногенний мутант з штаму 8, отриманий П.М. Жованіком у 1964 році;
B.abortus 174/В-1 - виробничий, одержаний з Херсонської біофабрики у 2001 році. На біофабрику поступив з ВДНКІ у 1980 році;
B.melitensis 151/Rev-1а - дисоціант із вакцинного штаму Rev-1;
B.suis 152/11-2 - епізоотичний, ізольований від морської свинки в біопробі, Одеська облветлабораторія, 1991 рік;
B.suis 171/0184 - епізоотичний, ізольований від хряка КСП "Зоря", Чаплинського р-ну, Херсонської обл. у 1999 році;
B.suis 172/112 - епізоотичний, ізольований від хряка КСП "Ландрас", АР Крим у 1999 році;
B.ovis 65/65939 - еталонний, отримано із ВДНКІ у 1973 році;
B.ovis 67/Б - епізоотичний, ізольований у 1972 році від барана в Болградській ГПС, Одеської області;
B.ovis 76/982 - епізоотичний, ізольований у 1973 році від барана радгоспу "Яровський", Тарутинського р-ну, Одеської обл;
B.ovis 78/3131 - епізоотичний, ізольований у 1973 році від барана колгоспу ім. Леніна, Саратського р-ну, Одеської обл;
B.ovis 154/8206 - епізоотичний, ізольований у 1991 році від барана в Тячівській ветлабораторії, Закарпатська обл.;
B.ovis 155/8162 - епізоотичний, ізольований у 1991 році від барана в Тячівській ветлабораторії, Закарпатська обл.;
B.ovis 156/7807 - епізоотичний, ізольований у 1991 році від барана в Тячівській ветлабораторії, Закарпатської обл.;
B.ovis 157/4151 - епізоотичний, ізольований у 1991 році від барана в Тячівській РВЛ, Закарпатська обл.;
B.ovis 158/04496 - епізоотичний, ізольований у 1991 році від барана в Тячівській РВЛ, Закарпатська обл.;
B.ovis 159/8406 - вірулентний, ізольований від барана в Ліпецькій обл. у 1988 році, одержано з ВІЕВ у 1991 році;
B.ovis 162/08337 - епізоотичний, ізольований від барана у 1993 році ДПЗ "Славне", Раздольнянський р-н, АР Крим;
B.ovis 166/13575 - епізоотичний, ізольований від ба