ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Экспериментальная часть выполнена на 800 белых крысах линии Вистар, массой 220-260 граммов, 10 беспородных собаках массой 10-20 кг. Все животные содержались на стандартном рационе питания вивария.
Оценка антиоксидантной активности (АОА) вновь синтезированных соединений проводилась в 2 этапа: в опытах in vitro и на моделях экспериментальной патологии.
Методы in vitro отличаются высокой специфичностью, не требуют высоких затрат на реактивы и приборы, позволяют исключить из модельной системы посторонние факторы, которые могут влиять на свободнорадикальный процесс, дают возможность количественной оценки АОА исследуемых веществ и одновременно скрининга большого количества соединений [2, 68, 192].
Все методы оценки антиоксидантной активности по механизму инициирования СРО можно разделить на три группы:
1. методы ферментативного инициирования
2. методы неферментативного инициирования
3. методы оценки по ингибированию активных форм кислорода.
Ферментативное инициирование моделируют в гидрофильных средах (гомогенаты ткани, плазма, ликвор, взвесь мембран эритроцитов), ПОЛ инициируется избытком восстановленных форм пиридиновых нуклеотидов, которые активируют, в конечном счете, все этапы процесса СРПО при наличии в системе ферментов антирадикальной и антиперекисной защиты. Данная модель оценки АОА соединений является интегральной: она учитывает взаимодействие веществ как с ферментами защиты, так и со свободными радикалами, то есть прямой и непрямой антиоксидантный эффект веществ.
Ферментативное инициирование проводили путём добавления избытка никотинамидаденилнуклеотида восстановленного (НАДФ?Н) в гомогенаты тканей мозга белых крыс. АОА оценивали по степени снижения образования конечного продукта ПОЛ - МДА в гомогенате [1].
Ход определения:
К 0,5 мл цитозольной вытяжки мозга белых крыс, приготовленного на 0,15 М фосфатном буфере, pH 7,4 (из расчёта 200 мл гомогената на 12 мл буферного раствора, с последующим центрифугированием при 12000 об/мин в течении 15 минут), добавляли 0,2 мл 50,0 мМ раствора НАДФН. Исследуемые вещества вводились в систему в виде водных растворов в дозах кратных их молекулярным массам, затем систему инкубировали в течение 30 минут при температуре 37?С. Содержание МДА после инкубирования определяли по реакции с тиобарбитуратовой кислотой, спектрофотометрически.
АОА высчитывали по формуле;
> Сх - концентрация МДА в контрольных пробах;
> Со - концентрация МДА в опытных пробах.
АОА выражали в процентах торможения образования МДА.
Неферментативное инициирование проводят в липофильных средах (взвесь ненасыщенных жирных кислот, взвесь липосом, взвесь липопротеидов). ПОЛ инициируют добавлением избытка восстановителя: Fe2+, аскорбиновой кислотой, либо их смесью. В результате в данной системе происходит образование радикалов жирных кислот и липоперекисей. Данная модель позволяет оценивать АОА веществ, действующих на последнем этапе СРПО.
В работе неферментативное инициирование моделировали путём добавления солей двух валентного железа к суспензии яичных липопротеидов.
Ход определения:
Рабочее количество суспензии яичных липопротеидов (приготовленных из расчёта липопротеиды-0,15 М КCl 1:1) разводили в 10 раз 40 мМ фосфатным буфером до рН 7,4. К 4 мл суспензии добавляли 1 мл водного раствора исследуемых веществ, в дозе 3 мг/мл и 1,0 мл 25 мМ сульфата закисного железа. Смесь инкубировали 30 минут при 35?С, затем прибавляли 1 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты и 15 минут центрифугировали при 3000 об/мин. МДА в 1 мл надосадка определяли по реакции с тиобарбитуровой кислотой спектрофотометрически. Развившуюся окраску фотометрировали при длине волны 532 нм.
АОА вычисляли по формуле:
> Сх- концентрация МДА в контрольных пробах.
> Со- концентрация МДА в опытной пробе.
АОА выражали в процентах торможения образования МДА.
АОА соединений по ингибированию активной формы кислорода - супероксидрадикала, определяли в реакции аутоокисления адреналина в аденохром в щелочной среде. Этот метод позволяет вести поиск антиоксидантов, действующих на инициальных этапах СРПО.
Ход определения:
В кювету с толщиной слоя 10 мм спектрофотометра СФ-26 вносили 2 мл 0,15 М натрий карбонатного буфера рН 10,2 с добавлением 3*10-4 М раствора натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (трилон Б), затем добавляли водные растворы исследуемых веществ в дозах кратных их молекулярным массам. Реакцию запускали добавлением 0,4 мл водного раствора адреналина (2,25*10-3 М), который доводили хлористоводородной кислотой до рН 2,25. Реакцию проводили при температуре 35-36?С при времени экспозиции 3 минуты. АОА исследуемых веществ определяли спектрофотометрически по торможению аутоокисления адреналина в окрашенный продукт - аденохром, при длине волны 480 нм и выражали в процентах. Вычисления проводили по формуле:
> ДХ - оптическая плотность, отражающая скорость неингибированного аутоокисления адреналина;
> До - оптическая плотность, отражающая скорость ингибированного аутоокисления адреналина в присутствии исследуемых веществ.
Соответственно с программой исследования, использовали общепринятые в данное время модели экспериментального нарушения мозгового кровообращения: одно- и двусторонние перевязки общей сонной артерии и введение аутокрови, полученной из хвостовой вены крыс, и из бедренной вены у собак, в участок внутренней капсулы, соответственно координатам стереотаксического атласа [46, 73].
Острую ишемию и реперфузию головного мозга моделировали путем временного выключения кровотока по брахиоцефальным артериям, за счет наложения (30 минут) и снятия лигатуры [116].
Для оценки тяжести ишемического повреждения тканей мозга и эффективности фармакоррекции проводились биохимические исследования в артериальной и венозной крови. С целью изучения отдаленных результатов фармакоррекции, у экспериментальных животных на 3 сутки после операции забирался головной мозг.
- Київ+380960830922