РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Дослідження проведені протягом 1999-2002 років у лабораторії кафедри фізики та вищої математики Білоцерківського державного аграрного університету. Для дослідів використовували свіже інкубаційне яйце перепела японського. Прогріте до температури
35-37°С інкубаційне яйце через 2 години після закладки на інкубацію опромінювали у затемненому приміщенні розфокусованим випромінюванням інфрачервоного лазера МИТ-1ИК при довжині хвилі 840 нм або гелій-неонового лазера марки ЛГН-111 та ЛГН-602 Н при довжині світлової хвилі 632,8 нм. Для отримання різних доз варіювали густину потужності лазерного випромінювання від 0,005 мВт/см2до 30 мВт/см2 при сталому часі впливу на ембріони,
який становив 60 с. Розсіювання лазерного променя забезпечувалося системою розфокусуючих лінз.
Інкубацію здійснювали у лабораторному інкубаторі ИЛУ Ф - 03 з дотриманням стандартних вимог до процесу інкубації перепелиного яйця [27; 159].
Для вивчення впливу лазерного випромінювання на ранній ембріональний розвиток перепелиних ембріонів застосовували сім режимів опромінення яєць інфрачервоним лазерним світлом (табл. 2.1) та шість режимів із застосуванням випромінювання гелій-неонового лазера (табл. 2.2).
Критерієм оцінки інтенсивності розвитку ембріонів на ранніх стоках була кількість диференційованих пар сомітів, що сформувалися до 38-ї години інкубації. Цей показник характеризує ранній ембріогенез, у зв'язку із постійністю часу, необхідного для утворення
Таблиця 2.1.
Схема досліду з вивчення впливу інфрачервоного лазерного випромінювання на ранній ембріональний розвиток перепела японського
Параметри опроміненняГрупа1234567Густина потужності, мВж/см2 0,0050,050,52050145-Час, с60Доза опромінення, мДж/см2 0,3330120030008700Контроль
Таблиця 2.2.
Схема досліду з вивчення впливу інфрачервоного лазерного випромінювання на ранній ембріональний розвиток перепела японського
Параметри опроміненняГрупа123456Густина потужності, мВж/см2 0,0050,050,5220-Час, с60Доза опромінення, мДж/см2 0,33301201200Контроль
однієї пари сомітів [148; 166; 205; 243; 254; 283]. Соміти вважали такими, що сформувалися, якщо борозда, яка відокремлює їх від каудально розміщеної пресоматичної мезодерми була добре помітною. Для отримання препаратів ембріонів яйця на 38 годину інкубації забирали з інкубатора та охолоджували у проточній воді протягом 30 хвилин [118; 143]. В тупому кінці яйця ножицями проколювали шкаралупу (для того, щоб вміст яйця дещо опустився, заповнивши повітряну камеру) та вирізали овальний отвір над місцем розташування зародка. Після видалення піпеткою білка, жовток переносили на годинникове скельце так, щоб ембріон розташувався зверху. Потім ембріон знімали із жовтка за допомогою кілець із фільтрувального паперу шириною 3-4 мм та зовнішнім діаметром 18 мм. Кільце акуратно накладали на поверхню жовтка у місці розташування ембріона так, щоб останній опинився у внутрішньому отворі. Ножицями швидко обрізали жовткову оболонку навколо кільця. За допомогою пінцета кільце з ембріоном переносили у чашку Петрі із дистильованою водою та відмивали від залишку жовтка. Відмиті ембріони фіксували на предметному скельці 3-5 % розчином трихлороцтової кислоти та вивчали при малому збільшенні мікроскопа (8?7). Препарати ембріонів фотографували при збільшенні (8?5).
Для вивчення впливу низькоінтенсивного лазерного випромінювання на метаболізм та гематологічні показники перепела японського протягом ембріонального розвитку використовували 4 дози інфрачервоного випромінювання лазера та 4 дози червоного гелій-неонового випромінювання. З кожної дослідної та контрольної групи брали по 7 інкубаційних яєць на кожний строк аналізу. Досліджували гомогенати та печінку ембріонів різних строків інкубації та добових перепелят.
Матеріал для визначення активності ферментів антиоксидантного захисту та вмісту продуктів пероксидного окислення ліпідів відбирали на 5-у, 7-у, 10-у, 13-у, 15-у добу інкубації та у добового молодняку. Ці терміни відповідають основним етапам розвитку перепелиного ембріону [36]: зародковому періоду, передплідному, замиканню алантоїсу, плідному періоду та періоду виведення. На 5 та 7 добу інкубації ембріони звільняли від оболонок, декапітували та готували гомогенати тканин ембріонів у 50 М Трис-HCl буфері (рН=7,4) із розведенням 1:10. У 10, 13, 15-добових ембріонів досліджували гомогенати печінки (1:100). Добових перепеленят декапітували, розтинали черевну порожнину та відбирали зразки тканин печінки.
Гематологічні показники досліджували у 15-добових ембріонів та у добового молодняку перепелів.
Відбір проб здійснювали в ранкові часи з метою виключення можливого впливу циркадних ритмів на показники, що аналізувалися.
Для визначення активності супероксиддисмутази застосовували метод [172], заснований на здатності фермента конкурувати з нітросинім тетразолієм за супероксидні аніони. При аеробній взаємодії відновленого никотинаміддинуклеотиду і феназинметасульфату НСТ відновлюється з утворенням гідразинтетразолія. За присутності СОД процент відновлення НСТ зменшується. Попередньо, для очистки тканин від баластних речовин, що заважають визначенню ферменту, еритроцити відмивали 0,85 % розчином NaCl, гемолізували шляхом заморожування та до 1 мл гемолізату додавали 0,3 мл етанолу і 0,15 мл хлороформу (при ретельному перемішуванні). Реакцію проводили при температурі
24-25°С. Оптичну густину досліджуваних проб визначали в кюветі з довжиною оптичного шляху 1 см на спектрофотометрі Spekol 11 (Німеччина) при ?=540 нм. Активність ферменту вираховували за формулою:
де Е0 - екстинкція реакційної суміші за відсутності ферменту (холоста проба)
ЕПР - екстинкція дослідної проби.
Активність каталази оцінювали у реакції пероксиду водню із солями молібдену за методом [88], в результаті якої утворюється забарвлений комплекс.
Метод визначе