ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Экспериментальные животные и модели злокачественного роста
Исследования проведены на 6-8-недельных мышах-самцах линий C57BL/6 (362 особи) и BALB/c (105 особей) весом 19±1 г разводки вивария Института экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им Р.Е. Кавецкого НАН Украины в соответствии с международными правилами проведения работ с экспериментальными животными.
В качестве моделей злокачественных клеток в исследовании были использованы линейно-специфические штаммы спонтанно метастазирующих карциномы 3LL и меланомы В16, перевиваемые на мышах C57BL/6, и линейно-специфический штамм перевивной, индуцированной 20-метилхолантреном, неметастазирующей рабдомиосаркомы (МХА саркомы), перевиваемый на мышах BALB/c и прошедший не более 5 пассажей. Данные модели интересны тем, что спонтанно образуют агрегаты in vitro.
Перевивку опухолевых клеток осуществляли путем введения 1х106 изолированных опухолевых клеток в 100 мкл физиологического раствора подкожно (карцинома 3LL и меланома B16) и внутримышечно (МХА саркома) в область бедра.
Количество нейраминовой кислоты в опухолевой ткани, миграционную активность и метастазирование карциномы 3LL оценивали на 17-е сутки, 21-е сутки, 24-е сутки и 28-е сутки после перевивки опухоли. Количество нейраминовой кислоты в динамике роста опухоли определяли с помощью резорцин-перйодатного метода [179]. Количество метастазов в легких подсчитывали визуально. На каждые сутки брали 5-7 мышей.
Для всех остальных опытов брали опухолевую ткань в период с 15 по 18 сутки после перевивки. Каждый опыт повторяли не менее 5-ти раз, для каждого раза брали группу из 10-ти животных.
2. Выявление на поверхности злокачественных клеток эндогенных лектинов
Получение опухолевых клеток. Животных с опухолью усыпляли под эфирным наркозом. Извлекали узлы опухолевой ткани, очищали от соединительной ткани и кровяных сгустков и измельчали. Измельченную ткань дважды промывали большими объемами раствора Haenk's для удаления дебриса, эритроцитов и слизи.
Для выделения клеток карциномы 3LL механически измельченную ткань опухоли дезагрегировали раствором Haenk's, содержащим 0,25% трипсина ("Spofa", Чехия). Учитывая чувствительность клеток меланомы В16 и МХА саркомы к воздействию трипсина, его концентрация была снижена до 0,18% с целью уменьшения количества погибших клеток. Трипсинизацию проводили в плоскодонных колбах объемом 50 мл 2-4 раза по 10 мин на магнитной мешалке при 37оС. После окончания каждого цикла ферментативной обработки получали порции клеток, которые затем объединяли. Действие трипсина подавляли 3-5-тикратным объемом холодной среды 199, содержащей 10% инактивированной нагреванием бычьей сыворотки. Полученную взвесь отмывали и центрифугировали при 425 g (1 500 об. в мин) 10 мин. Осадок ресуспендировали в среде 199 и фильтровали через 4-хслойный капроновый фильтр. Полученную клеточную суспензию трижды отмывали на той же скорости и ресуспендировали в среде 199. Подсчитывали количество жизнеспособных клеток в камере Горяева, при суправитальной окраске трипановым синим. Процент жизнеспособных клеток во всех опытах составлял не менее 98%.
Культивирование опухолевых клеток проводили в 6-ти луночных полистироловых планшетах ("Nunk", Дания) на протяжении 24, 48 и 72 часов при 37ОС в атмосфере с 5% СО2. В каждую лунку вносили по 3х106/мл клеток и 6 мл среды Eagle'а ("Sigma", США), содержащей 5% эмбриональной сыворотки телят (БіоМарк, Украина), 2% L-глютамина ("Sigma", США) и 20 мкг/мл гентамицина ("Pharmachim", Болгария).
Получение цитологических препаратов. Цитологические препараты в виде высушенных капель получали рутинным способом [180]. Вкратце, суспензию опухолевых клеток, трижды отмытую от сыворотки, разводили раствором Haenk's до концентрации 2х106/мл и наносили на предметные стекла. Стекла помещали во влажную камеру и инкубировали на протяжении 20 мин при 4ОС для оседания клеток. Затем стекло извлекали из камеры, снимали излишек жидкости и подсушивали осевший слой клеток при комнатной температуре под вентилятором.
Фиксация цитологических препаратов [180]. Полученные цитологические препараты фиксировали в парах 10%-ного нейтрального формалина 3 мин. Затем отмывали стекла трижды в среде с рН 7,2-7,4 и, не допуская высыхания препаратов, приступали к выполнению иммуноцитохимической реакции.
Выявление на поверхности злокачественных клеток рецепторов к углеводным зондам. В работе были использованы двадцать два углеводных зонда, специфичность которых перечислена в таблице 2.1. Специфические зонды-гликоконьюгаты, которые были синтезированы и любезно предоставлены Н.В.Бовиным и сотр. (Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина РАН), представляют собой водорастворимый биотинилированный полиакриламид, содержащий остатки моно- или олигосахаридов [181]. Базовый раствор, содержащий азид натрия (1мг/мл), хранили при 4оС или в соотношении 1:1 с глицерином (хч) при -20оС. Водные растворы полиакриламидных зондов стойкие и их титр не снижается при хранении при 4оС на протяжении 4-6 месяцев. Зонды растворяли в физиологическом растворе, забуференном фосфатным буфером (ЗФР) с рН 7,2-7,4 и использовали в концентрации 1 мг/мл [182].
Таблица 2.1
Специфичность углеводных зондов, использованных в работе
(в скобках указаны традиционные названия углеводных детерминант).
№Специфичность углеводного зонда1маннозил2фосфорилированный маннозил3?-галактозил4?-глюкозил5?-ацетилгалактозамин6?-ацетилглюкозамин7остаток нейраминовой кислоты8лактозил9?-фукозил-1>2-галактозил (H- дисахарид)10фукозил-1>3-?-ацетилглюкозаминил11галактозил-1>3-?-ацетилглюкозаминил (антиген Thomsen-Friedenreich'a)12?-галактозил-1>3-?-?-ацетилгалактозаминил ( предшественник 3-го типа)13?-галактозил-1>3-?-?-ацетилгалактозаминил14?-фукозил-1>4-?-?-ацетилглюкозаминил (дисахарид Lewis'а)15?-ацетилгалактозиламинил-1>3-?-галактозил16?-?-ацетилгалактозаминил-1>3-(1>2-?-фукозил )-?-г