ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Питательные среды, материал для исследования
2.1.1. Для выделения и культивирования штаммов протеев использовали
мясопептонный бульон, мясопептонный агар, агар Эндо, кровяной агар и 2-4% агар
Хоттингера, которые были приготовлены по общепринятой методике. Для получения
чистой культуры протеев, проводили посев по Шукевичу.
2.1.2. Для идентификации и определения чувствительности выделенных бактерий
использовали наборы «МИКРО-ЛА-ТЕСТ» (PLIVA-Lachema, Чешская республика).
2.1.3. Среда для определения гемолитической активности: 4% агар Хоттингера с рН
7,4, охлажденный до 450С – 95 мл, дефибринированная кровь кролика – 5мл. Смесь
перемешивали, разливали в стерильные чашки Петри.
2.1.4. Среда для определения ДНК-азной активности: ДНК – агар Дифко – 3,0 г,
МПБ – 96 мл (рН 7,4 – 7,6), агар Дифко – 1,0 г. Ингредиенты смешивали,
нагревали до гомогенной массы, стерилизовали при 121 0 С в течение 30 минут,
разливали в стерильные чашки Петри по 12 мл, сушили в термостате в течение 30
минут.
2.1.5. Реактивы для определения субпопуляций Т – лимфоцитов периферической
крови
2.1.5.1. Использовали моноклональные антитела (МКАТ) в реакции мембранной
иммунофлюоресценции (РИФ).
Приборы: микроскоп флюоресцентный. Посуда: планшеты 96 луночные
иммунологические, пробирки химические. Реактивы: МКАТ, фиколл, верографин,
ФИТЦ, среда 199, фосфатный буфер. Для постановки РИФ использовали пробирки и
планшеты (96 луночных панелях, объем лунки – 0,2 мл).
2.1.5.2. Реактивы для определение лимфоцитов в градиенте плотности. Реактивы:
1. Раствор фиколла – 400: 8,64 г фиколла добавляют в колбу с 96 мл
дистиллированной воды, подогретой до 50 – 700С, колбу помещали на водяную баню
до полного растворения фиколла. 2. Раствор уротраста: 20,28 мл 75% раствора
уротраста доводили дистиллированной водой до 42 мл. 3. Раствор Хенкса или среда
199. 4. 3% раствор уксусной кислоты. 5. Физиологический раствор. 6. 0,2%
раствор трипанового синего: 200 мг сухого красителя растворяют в 100 мл
физиологического раствора или 0,5% раствор эозина: 500 мг сухого красителя
растворяли в 100 мл физиологического раствора. Смешивая фиколл – уротраст в
определенном соотношении, получали раствор с плотностью 1,077 г/мл.
2.1.5.3. Реактивы для определения дифференцированных антигенов Т-лимфоцитов
методом иммунофлюоресценции. 1. Дегидрофосфат натрия (NaH2PO4 х 2H2O); 2.
Гидрофосфат натрия (NaHPO4 х 12H2O), хлорид натрия; 3. Поли – L – лизин (М.м.
40 – 80 кДа) – 0,01% раствор поли – L – лизина получали, добавляя к 1 мг сухого
вещества 10 мл дистиллированной воды или 0,4% раствор формовара в дихлорэтане;
4. Моноклональные антитела; 5. Антимышиный иммуноглобулин, меченый ФИТЦ; 6.
0,001% раствор бромида этидия: 1 мг красителя растворяли в 100 мл забуференного
физиологического раствора (ЗБР); 7. Забуференного физиологического раствора
(ЗБР): 15,6 гр NaH2PO4 х 2H2O растворяли в дистиллированной воде, доводили
объем раствора до 1 литра (раствор №1); 35,8 г NaHPO4 х 12H2O растворяли в
дистиллированной воде, доводили объем раствора до 1 литра (раствор №2).
Смешивали 200 мл раствора №1 и 800 мл раствора №2, к полученной смеси
прибавляли 8,5 гр NaCl : рН раствора должно быть 7,2 – 7,4. Оборудование: рН
–метр, холодильник, термостат, люминесцентный микроскоп, влажная камера,
фильтровальная бумага, лабораторная посуда.
2.1.6. Реактивы для определения биохимических показателей:
2.1.6.1. Реактивы для определения содержания диеновых конъюгатов в сыворотке
крови: 1.Гептан эталонный, 2. Изопропиловый спирт, 3. Смесь Г-ИПС (1:1), 4. НCL
(кислота соляная).
2.1.6.2. Реактивы для определения содержания сульфгидрильных групп в крови с
реактивом Эллмана: 1. 5,5-дитиобиснитробензойная кислота, реактив Эллмана –
0,175мМ (М.м. 396); 2. Набор ХЭ Lachema.
2.1.6.3.Реактивы для определения содержания малонового диальдегида (МДА) в
сыворотке крови с тиобарбитуровой кислотой:
1.Трис – НCL буфер – 0,025 моль/л, рН 7,4; 2. Раствор тиобарбитуровой кислоты
(ТБК) – 7,5 г/л; 3.Раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ) – 300,0 г/л; 4.
Растворы соляной кислоты: а) 5,0 моль/л; б) 0,1 моль/л.
2.1.6.4. Реактивы для определения активности каталазы крови с субстратом Н2О2:
1. Аммоний молибденовокислый (NH4)2MoO4 – 40 г/л. Расстворяли при нагревании,
фильтровали; 2. Рабочий раствор перекиси водорода – 0,32 г/л (18мМ).
2.1.6.5. Реактивы для определения щелочной фосфатазы:1. Субстрат
4-нитрофенилфосфат, 0,92 ммоль/флакон; 2. Буфер N-метил-D-глюкаминовый, 42,6
ммоль/флакон; 3. Стандартный раствор – 4-нитрофенол, 2,4 ммоль/л
2.1.6.6.Реактивы для определения лактатдегидрогеназы:
1. Стандарт; 2. Цветной компонент (указан в инструкции); 3. Буферный раствор –
Трис 1 моль/л, детергент и стабилизатор; 4. Раствор сравнения – калия оксалат
11 ммоль/л; 5. Субстрат 1 – литий лактат 0,2 моль/л; 6. Субстрат 2 – литий
лактат 0,2 моль/л и мочевина 3 моль/л; 7. НАД – 0,05 ммоль/л никотинамидаденин
– динуклеатида/дозу.
2.1.6.7. Реактивы для определения креатинкиназы: 1. Стандартный раствор –
фосфор 1,20 ммоль/л; 2. Аммоний ванадевокислый – 2 ммоль/л в хлорной кислоте
0,5 моль/л; 3. Аммоний молибденовокислый – 30 ммоль/л; 4. Кислота
трихлоруксусная – раствор 1,53 моль/л; 5. Буфер: глицин 2,5 ммоль, натрий
углекислый 2 ммоль, магний сернокислый 0,17 ммоль, креатин 1,9 ммоль/1 доза; 7.
АТФ – 0,07 ммоль двунатриевой соли аденозинтрифосфата; 8. Активатор – 0,25
ммоль цистеин хлорида/1 доза.
2.1.6.8. Реактивы для определения гаптоглобина: указаны в инструкции по
применению набора PLIVA – Lachema a.s. Чешская Республика, Брно.
2.2. Материал для исследования.
Материал
- Київ+380960830922