РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для проведения экспериментов было использовано 60 белых беспородных крысах обоих полов массой 150-250г, а также 45 беспородных кроликах массой 0,7-4 кг. Исследования проводились в соответствии с правилами "Европейской конвенции защиты позвоночных животных, используемых с экспериментальной и другой научной целью" (1985 г.).
Объектом исследования служили изолированные гепатоциты крыс и кроликов, а также клетки плодовой печени кроликов.
2.1. Препаративные методы
Получение изолированных гепатоцитов и клеток плодовой печени. Гепатоциты крыс и кроликов получали неферментативным методом [142, 143]. Для этого брюшную полость анастезированного тиопенталом натрия животного вскрывали, канюлировали v. porta и закрепляли ее лигатурой, а v. cava sup. надсекали в месте ответвления правой почечной вены для оттока перфузата. Перфузию проводили сахарозо-солевым раствором, содержащим 4 мМ ЭДТА, рН 7,4 при 38?С в течение 15 минут со скоростью 25-35 мл/мин, в случае крыс, и 80 мл/мин, в случае кроликов, при помощи роликового перистальтического насоса. После окончания перфузии печень извлекали из брюшной полости, помещали в охлажденную до 0°С среду дезагрегации, содержащую 250 мМ сахарозы, 5,0 мМ KCl, 0,8 мМ MgCl2, 1,6 мМ Na2HPO4, 0,4 мМ KH2PO4, 1,2 мМ CaCl2, 10 мМ HEPES, 1% БСА, рН 7,4, и измельчали ножницами на кусочки величиной 2-3 мм. После этого измельченную печень переносили в пробирку, добавляли двойной объем охлажденной до 0?С среды дезагрегации и подвергали действию вибрации с частотой 50 Гц в течение 60 сек с помощью специального устройства, разработанного в ИПКиК НАН Украины [141]. В процессе вибрации более 70% массы печени переходило в одиночные клетки. Полученную суспензию фильтровали через нейлоновый фильтр и подвергали очистке путем 2-3-кратного центрифугирования при 200 g в течение 1-4 мин в той же среде. Центрифугирование суспензии клеток приводило к разделению гепатоцитов на два слоя, из которых нижний, более темный, содержал в основном клетки с нативной плазматической мембраной, которые не прокрашивались витальным красителем.
Клетки плодовой печени были выделены, как описано [37], из плодов кроликов 20 суток гестации.
Жизнеспособность изолированных гепатоцитов и клеток плодовой печени оценивали по окрашиванию витальным красителем трипановым синим [158]. Для этого клетки инкубировали (1:1) с 0,6% раствором красителя (приготовленным на 0,9%-ом растворе NaCl, pH 7.4) в течение 5 мин при комнатной температуре и затем подсчитывали долю поврежденных клеток, которые имели выраженную голубую окраску ядра и цитоплазмы. Подсчет клеток проводили в камере Горяева, параллельно определяя и их концентрацию по стандартной методике [35].
Криоконсервирование суспензий гепатоцитов и клеток плодовой печени проводили по 3-х этапной программе замораживания [141] с начальной скоростью 1 ?С/мин до - 40 ?С, 10 ?С/мин от - 40 ?С до -80 ?С с последующим погружением в жидкий азот. Среда криоконсервирования содержала 250 мМ сахарозы, 5 мМ KCl, 1.6 мМ Na2HPO4, 0.4 мМ KH2PO4, 0.8 мМ MgCl2, 1.2 мМ CaCl2 (pH 7.4) и 5 % ДМСО. Хранение клеток осуществляли при -196?С в условиях низкотемпературного банка ИПКиК НАНУ в течение 2-3 мес.
2.2. Экспериментальные модели
Для моделирования транспортировки криоконсервированных изолированных гепатоцитов при температуре сухого льда (194,5 К) контейнеры с гепатоцитами, криоконсервированными по описанной выше методике, на 2 часа переносили из жидкого азота (77 К) в охлажденную до 194,5 К камеру программного замораживателя. После этого контейнеры возвращали в жидкий азот. Проводили несколько циклов таких переносов (циклирование), после каждого цикла часть гепатоцитов размораживали для подсчета жизнеспособности и количества клеток.
100-кратное температурное циклирование криоконсервированных изолированных гепатоцитов крыс в диапазонах температур 77?223, 77?173 и 77?123 К осуществляли на установке для циклирования биологических объектов, разработанной в отделе криобиофизики ИПКиК НАН Украины [14].
Для изучения способности изолированных гепатоцитов крыс влиять на уровень атерогенных липопротеинов гиперхолестеринемическую сыворотку крови инкубировали с суспензией гепатоцитов. Сыворотку крови человека для проведения экспериментов брали от больных с гиперхолестеринемией. В опыте использовались гепатоциты крыс с высокой жизнеспособностью (75%), а также клетки, полученные путем быстрого замораживания-отогрева без криопротектора (практически нулевая жизнеспособность). Объем сыворотки в одной пробе составлял 0,5 мл. Концентрации гепатоцитов - 2 и 8 млн/мл. Инкубация проводилась при температуре 37?С в течение 3 часов при постоянном, исключающем осаждение клеток помешивании с помощью шейкера. После инкубации гепатоциты осаждались центрифугированием при 200 g в течение 5 минут, после чего отбирались пробы супернатанта для определения содержания атерогенных липопротеинов турбидиметрическим методом, а также содержания общего ХС по реакции Златкис-Зака после предварительной экстракции общих липидов по методу Блая-Дайера (см. 2.3).
В экспериментах по изучению влияния скорости интрапортальной инфузии криоконсервированных гепатоцитов и клеток плодовой на состояние печени реципиентов использовали самцов кроликов массой более 2 кг. Животных разбили на 4 группы (n=5). Кроликам первой группы вводили криоконсервированные зрелые гепатоциты, суспендированные в 20 мл раствора Хенкса, в количестве 108 клеток на реципиента со скоростью 4 мл/мин. Вторая группа была подвергнута введению аналогичной клеточной суспензии со скоростью 1 мл/мин. В предварительных экспериментах распределение гепатоцитов в печени оценивали визуально при дополнительном включении в состав инфузата 0,6% трипанового синего. Третьей группе вводили по 5?108 криоконсервированных клеток плодовой печени в том же объеме со скоростью 1 мл/мин. Четвертой - контрольной - по 20 мл раствора Хенкса. Трансплантацию осуществляли под внутривенным на