РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
З метою дослідження впливу фізіологічного стану - тільності і лактації - на стан антиоксидантної ситеми і метаболічний профіль крові корів та впливу різного рівня цинку в їх раціоні на активність неферментативної і ферментативної ланок антиоксидантної системи та метаболічний профіль крові, молочну продуктивність і вміст цинку в молоці, інтенсивність росту одержаних від них телят і активність антиоксидантної системи в їх організмі проведено дослід на трьох групах корів чорно-рябої породи 2-3-ї лактації, по 5 голів у кожній групі. Корови утримувались прив'язним способом у стандартному приміщенні. У літній період корови випасались на культурному пасовищі і додатково отримували коцентровані корми (комбікорм). У стійловий період раціцон корів складався з сіна, сінажу, силосу, комбікорму. Раціон корів забезпечував потребу корів в основних елементах живлення згідно деталізованих норм (ВАСХНІЛ, 1985). Вміст цинку у раціоні корів протягом досліду становив 540-620 мг на голову в день.
Перша група корів, яким згодовували вказаний раціон ( основний раціон) правила за контроль. Коровам 1-ї і 2-ї дослідних груп згодовували основний раціон з добавками цинку в кількості відповідно 180 і 360 мг на голову в день у вигляді добавок до комбікорму. Джерелом цинку служив сульфат цинку.
Протягом досліду в корів кожної групи щоденно визначали надій, раз у декаду в молоці визначали вміст жиру, реєстрували строки їх отелення і осіменіння.
Для біохімічних досліджень від корів одержували кров з яремної вени в останній місяць тільності ( за 15-25 днів до отелення), через 2, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 30 днів, 2, 3, 6, 9 місяців після отелення. Крім того для біохімічних досліджень використовували кров телят, одержаних від досліджуваних корів, у 1-, 5-, 10- і 30-денному віці. Як антикоагулянт використовували гепарин. Плазму крові для досліджень одержували шляхом центрифугування цільної крові при 3000 об/хв протягом 10 хв. Одержані еритроцити 4-5 разів промивали 0,15 М розчином NaCl на 5мМ фосфатному буфері (рН - 7,4) при температурі 2-4оC . С з наступним центрифугуванням 10 хв при 5000 об/хв. Гемоліз еритроцитів проводили шляхом додавання їх до двох об'ємів охолодженої дистильованої води і дворазового заморожування в рідкому азоті. Гемолізат звільняли від строми еритроцитів шляхом центрифугування протягом 5 хв. при 1000 об/хв.
2.1. Визначення активності супероксиддисмутази в еритроцитах
При визначенні активності супероксиддисмутази в еритроцитах враховували рівень інгібування відновлення нітросинього тетразолю в присутності НАДН і феназинметасульфату. При цьому еритроцити відмивали від плазми фізіологічним розчином при температурі -40C. Осадження гемоглобіну проводили шляхом додавання до 0,1 мл гемолізованих еритроцитів, розведених у 10 разів 5 М трис-HCl (рН 7,4), 0,25 мл етанолу і 0,15 мл хлороформу. До складу інкубаційної суміші входило: 1 мкмоль ЕDТА; 1 мг желатину; 0,407 ммоль нітросинього тетразолю; 1,8 мкмоль феназинметасульфату; 0,1 мкмоль НАДН. Супернатант додавали до інкубаційної суміші в кількості 0,04-0,06 мл, що викликало гальмування відновлення нітросинього тетразолію від 30 до 70 %. Загальний об'єм інкубаційної суміші доводили до 3 мл фосфатним буфером (0,15 М , pH 7,8). Контрольні зразки містили ті самі компоненти за винятком супернатанту.
Реакцію починали додаванням НАДН у дослідні і контрольні зразки. Інкубацію проводили протягом 10 хв у темноті при кімнатній температурі (+20-220С) в аеробних умовах. Оптичну густину контрольних і дослідних зразків визначали на спектрофотометрі СФ-26 при довжині хвилі 540 нм. Активність СОД визначали за формулою:
А= КЕ-ДЕ x 2 (умовних одиниць/мг білку)
С
де: С - кількість білку в досліджуваному зразку в мг;
КЕ - екстинкція в контрольному зразку;
ДЕ - екстинкція в дослідному зразку.
2.2. Визначення активності глутатіонпероксидази в еритроцитах
Активність глутатіонпероксидази в еритроцитах визначали спектрофотометрично за методом В.М.Моіна (1986) в модифікації Г.Л.Антоняк, О.М.Бучко [8] Принцип методу полягає у визначенні швидкості окиснення глутатіону в присутності гідроперекису третинного бутилу. Концентрацію відновленого глутатіону визначали до і після реакції колориметрично. В основі розвитку кольорової реакції лежить взаємодія SH-груп з 5,5"-дитіо-біс-2-нітробензойною кислотою (ДТНБК) з утворенням забарвленого продукту - тіонітрофенільного аніону. Вміст останнього прямо пропорційний кількості SH-груп, що прореагували з ДТНБК.
Для визначення активності глутатіонпероксидази 100 мкл гемолізату додавали до 830 мкл 0,1 М, трис-HCl буферу (рН 8,5), який містив 6 мМ ЕDТА, 12 мМ азиду натрію (NaN3 ) і 4,8 мМ відновленого глутатіону та інкубували протягом 10 хв, після чого додавали 70 мкл 20 мМ гідроперекису третинного бутилу і інкубували 5 хв. Реакцію зупиняли додаванням 0,4 мл 10% ТХО. Інкубат центрифугували при 8000 об/хв протягом 10 хв. 0,1 мл супернатанту вносили в пробірки, які містили 5 мл 0,1 М трис-HCl буферу (рН 8,5), додавали 100 мкл 0,01 М розчину реактиву Елмана і через 5 хв. вимірювали оптичну густину при довжині хвилі 412 нм. Контрольний зразок відрізнявся від дослідного тим, що гемолізат вносили безпосередньо перед осадженням білків.
Активність глутатіонпероксидази розраховували за формулою:
А = (ЕК-ЕD)/ 11,4 (мкМ глутатіону / хв х мг білка)
5x С
де: С - кількість внесеного білка;
ЕК - екстинкція контрольного зразку;
ЕД - екстинкція дослідного зразку.
2.3. Визначення активності глутатіонредуктази в еритроцитах
Активність глутатіонредуктази визначали за методом С.Власова у модифікації Г.Л.Антоняк [7], в основі якого лежить відновлення окисненого глутатіону в 0,1 М фосфат