РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Об'єкти дослідження
В роботі використовували різні культури дріжджів з колекції відділу фізіології промислових мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології НАН України, Української колекції мікроорганізмів (УКМ), виділені з ґрунту, води, стічних вод промислових підприємств та шлунково-кишкового тракту людини. Всього було досліджено більше 110 штамів безпігментних культур дріжджів родів Debaryomyces, Kluyveromyces, Saccharomyces, Williopsis, Candida і пігментованих культур дріжджів родів Cryptococcus, Rhodotorula і Sporobolomyces. Видовий склад досліджених музейних дріжджів наведений в таблиці 2.1.
Таблиця 2.1.
Досліджені види музейних дріжджів
№ п/пВид, автори, рік описанняКількість штамів123Аскоміцетні дріжджі:1.Candida boidinii Ramirez, 199332.C. krusei (Castellani) Berkhout, 192343.C. tropicalis (Castellani) Berkhout, 192334.C. utilis (Henneberg) Lodder & Kreger-van Rij, 195225.Debaryomyces hansenii (Zoph) Lodder & Kreger-van Rij 195286.D. occidentalis (Klocker) Kurtzman & Robnett, 199147.D. polymorphus (Klocker) Price & Phaff, 197948.D. vanrijiae (van der Walt & Tscheuschner) Abadie, Pignal & Jacob, 196349.Kluyveromyces marxianus (E. C Hancen) van der Walt, 1971510.K. lactis (Dombrowski) van der Walt, 19715Продовження таблиці 2.1.12311.Metschnikowia pulcherrima Pitt & Miller, 1968512.Pichia anomala (E. C. Hansen) Kurtzman, 1984513.P. guilliermondii Wickerham, 1966414.Saccharomyces unisporus Jorgensen, 1909415.S. cerevisiae Meyen ex Hansen, 18831916.Williopsis californica (Lodder) von Arx, 19774Базидіоміцетні дріжджі:17.Cryptococcus albidus (Saito) Skinner, 1947418.C. laurentii (Kufferath) Skinner, 1950219.Rhodotorula glutinis (Fresenius) Harrison, 1928620.Rh. aurantiaca (Saito) Lodder, 1934321.Rh. minuta (Saito) Harrison, 1928322.Rh. mucilaginosa (Jorgenssen) Harrison, 1928823.Sporobolomyces roseus Kluyver & van Niel, 19244Всього:113
Отримання біомаси дріжджів
Біомасу дріжджів вирощували на середовищі Рідер наступного складу (г/л): (NH4)2SO4 - 3.0; K2HPO4 - 0.1; KH2PO4 - 1.0; MgSO4 - 0.7; NaCl - 0.5; глюкоза - 10.0; дріжджовий екстракт - 0.1%; pH 6.8. Для інокуляції використовували культури дріжджів 24 годинного росту на вищенаведеному середовищі. Культивування проводили в колбах Ейрленмейєра, що містили 100 мл середовища та 1 мл дріжджової суспензії з концентрацією клітин 107-108 кл/мл, при температурі 280С та постійному перемішуванні (220-240 об/хв.). Біомасу дріжджів у стаціонарній фазі росту відокремлювали від середовища центрифугуванням 4000g протягом 20 хв. та відмивали тричі стерильною водопровідною водою. Отримані дріжджі використовували в біосорбційних тестах.
Для проведення експериментів по оптимізації умов проведення сорбційного експерименту дріжджі вирощували на рідкому середовищі сусло та на середовищі Рідер з додаванням 1 % глюкози та 0,1 % дріжджового екстракту в аеробних умовах при температурі 280C. Культури дріжджів 48 годин росту відділяли від середовища центрифугуванням 4000g протягом 20 хв. Біомасу дріжджів відмивали двічі стерильною водопровідною водою та висушували при температурі 600C.
При проведенні рівноважних біосорбційних експериментів нежиттєздатні культури дріжджів отримували висушуванням біомаси до стану абсолютно сухої речовини (АСР) при 1050C, суху біомасу розтирали у фарфоровій ступі до однорідної порошкової маси та робили наважки кожного штаму по 25 мг.
Іони важких металів, що використовували у роботі
В роботі використовували основний розчин іонів Cu2+, Pb2+ та Cr6+ в концентрації 1 г/л дистильованої води на основі солей CuSO4, Pb(NO3)2, K2CrO4. Робочі розчини металів готували виходячи з основного розчину у MES буфері, у середовищі Рідер.
5 mM MES буфер отримували розчиненням 0.976 г 2-(N-морфоліно)-етансульфонової кислоти ((2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) Hydrate C6H13NO4S) в 1 л дистильованої води. Для отримання потрібного значення рН у розчин додавали кристали гідрооксиду тетраметил амонію (Tetramethyl - ammonium hydroxide) [123].
Скринінг культур дріжджів на різних середовищах
Виходячи з літературних даних [124, 125, 126] скринінг культур дріжджів здійснювали, використовуючи наважки сухої біомаси досліджуваних штамів дріжджів по 50 мг. Наважки вносили у 100 мл колби Ейренмейлера, які містили 50 мл 5 mM MES буфера та одну з досліджуваних солей Cu(NO3)2, Pb(NO3)2, K2CrO4. Початкова концентрація іонів металів була відповідно 50 мг/л Cu2+, 50 мг/л Pb2+ та 35 мг/л Cr6+ при рН 4.9-5. Як контроль використовували 5 mM MES буфер без доданого металу та наважку біомаси 50 мг. Контакт біомаси з іонами ВМ відбувався протягом 3 годин на качалках (240 об/хв.) при температурі 23?-25? C. Далі біомасу відділяли центрифугуванням 4000g протягом 20 хвилин. У надосадовій рідині вимірювали залишкову кількість іонів важких металів. Сорбційну активність дріжджів виражали у % сорбованого іону металу від загальної кількості внесеного іону металу.
Для проведення скринінгу на чашках з агаром використовували модифікований нами метод Thomas Pumpel et al.[127], який дає можливість застосовувати більшу кількість культур та значно економить тривалість дослідження. Для інокуляціі використовували культури дріжджів після 24 годин росту. На напіврідке середовище (10 г/л агару) Рідер з додаванням солей Cu(NO3)2, Pb(NO3)2, K2CrO4 проводили посів лабораторних штамів за допомогою крапельного методу (об'єм краплі 0.01 мл, концентрація клітин в ній - 107 кл/мл). Концентрація іонів важких металів склала 5 mM Cu2+, Cr6+ та 10mM Pb2+ для кожного окремо взятого середовища. Чашки с 4-8 колоніями інкубували 48 годин при 280С до того часу, доки найбільша колонія не досягала в діаметрі 4мм, потім переносили в ексикатор, де відбувався контакт середовища з H2S і колоніями дріжджів протягом 15 хв. Сірководень генерували 3 г Nа2S зі стехіометричною кількістю 10 %