РАЗДЕЛ 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Культивирование дрожжей
В работе был использован дикий штамм пивных дрожжей Saccharomyces cerevisiae,
полученный из лаборатории ОАО “Пивзавод “Рогань”, г. Харьков.
Чистую культуру дикого штамма пивных дрожжей Saccharomyces cerevisiae
выращивали на средах следующего состава:
солодово – дрожжевом бульоне: D-глюкоза – 1,0%, дрожжевой экстракт – 0,5%,
солодовый экстракт – 0,5%, рН=5,5 [32, 187].
солодовом бульоне: солодовый экстракт – 25%, рН=5,5 [108].
Культура дрожжей росла при температуре 24±1°С и постоянном перемешивании в
колбах объемом 250 мл. Объем среды культивирования составлял 90 – 100 мл. При
пересадке использовали 14-ти суточную культуру (стационарная фаза роста в
данных условиях). В среду культивирования при пересадке вносили около 10 клеток
дрожжей.
Культуру хранили на косяках, на глюкозо – дрожжевом агаре следующего состава: D
– глюкоза – 4,0%, дрожжевой экстракт – 0,5%, агар – 2,0%, рН=5,8 – 6,0 при
температуре около 3 – 5°С [108]. Пересев маточной культуры дрожжей, хранящейся
на косяках, на свежую среду проводили 1 раз в 4 месяца.
2.2. Определение динамики роста культуры и диаметра клеток культуры дрожжей
В ходе экспериментов определяли динамику роста культуры дрожжей по количеству
клеток (подсчет проводили в камере Горяева), а также общепринятым методом на
спектрофотометре СФ-46 (“ЛОМО”, Россия) при длине волны 550 нм. Количество
клеток рассчитывали по калибровочной кривой (клеток/мл). Нативность
плазматической мембраны при культивировании клеток оценивали по окраске
красителем, трипановым синим 0,8% [188]. В стандартных условиях культивирования
стационарная фаза наступала на 7 сутки роста культуры дрожжей и продолжалась до
25 – 26 суток роста.
Диаметр клеток измеряли при помощи на микроскопа МБИ-6 с окуляр – микрометром
(увеличение 600 раз).
2.3. Культивирование мицелиальных грибов
Продуцентами комплекса гидролитических ферментов являлись мицелиальные грибы
Chaetomium globossum Kunze:Fr., выращенные в глубинной культуре на среде
Гетчинсона [1899] с источником углерода глюкозой, Trichoderma viride Pers.et
Harz., Bipolaris sorokiniana Sacc.et Shoem., и Fusarium sp., выращенные на
среде Чапека – Докса [189]. Грибы культивировали при постоянном освещении и
перемешивании, температура культивирования мицелиальных грибов составляла 25 ±
1°С.
В качестве продуцента гидролитических ферментов был использован мицелиальный
гриб Chaetomium globossum Kunze: Fr., изолят которого выделяли из компоста,
приготовленного для культивирования огурцов в закрытом грунте (1 ч. почвы : 2
ч. соломы) методом серийных разведений по Ваксману [190], используя среду
Чапека – Докса. После созревания клейстотециев споры изолировали и высевали на
среду Чапека – Докса.
Отдельные колонии, полученные из проросших аскоспор, рассевали в пробирки и
таким образом получали моноспоровый изолят Chaetomium globossum Kunze: Fr.
Полученный изолят переводили на среду Гетчинсона с целлюлозой в качестве
источника углерода. Маточная культура мицелиального гриба Chaetomium globossum
Kunze поддерживалась на 10% среде сусло-агар [189].
2.4. Получение гидролитических ферментов и их внесение в биомассу дрожжей
Для получения гидролитических ферментов маточную культуру переводили в
глубинную культуру, в состав которой входил отвар ржи с 0,5% содержанием сухих
дрожжей в качестве источника углерода.
Сбор культурального фильтрата проводили на 4 сутки роста. Для этого биомассу
гриба и неразрешенные клетки сухих дрожжей удаляли центрифугированием при 3000
g 15 минут и двукратной фильтрацией через бумажный фильтр. В полученной жидкой
фазе культуральной среды содержались гидролитические ферменты, являющиеся
экстрацеллюлярными белками.
Биомассу дрожжей дважды отмывали от среды культивирования дистиллированной
водой и концентрировали центрифугированием 3000g в течение 10 минут. В колбы
объемом 50 мл вносили около 10 7 клеток дрожжей в 1 мл. Для автолиза суспензию
дрожжей разводили дистиллированной водой в соотношении 4 мл воды на 1 мл
суспензии дрожжей и инкубировали при 37°С и 50°С в течение 12 и 24 часов.
Гидролиз с ферментными комплексами мицелиальных грибов проводили в 4 мл
культуральной среды продуцента при температуре 37°С в течение 12 и 24 часов.
Содержание белка в ферментных комплексах составляло 0,500 ± 0,075мг/мл.
2.5. Внесение этилового спирта в культуральную среду дрожжей
Для оценки влияния времени внесения этилового спирта на содержание эргостерина
в клетках дрожжей спирт вносили в среду культивирования в начале
экспоненциальной фазы роста (спустя 4 – 5 часов после пересева культуры на
свежую среду), в конце экспоненциальной фазы роста (7-е сутки) и в первой
половине стационарной фазы роста (10-е сутки роста). Вносили 96% этиловый спирт
до конечной концентрации 0,3%.
2.6. Внесение ионов кальция в культуральную среду дрожжей
Для оценки влияния ионов кальция на содержание эргостерина в клетках дрожжей
кальций вносили в свежую питательную среду непосредственно перед пересевом
культуры в виде хлорида кальция (CaCl). Конечная концентрация хлорида кальция в
среде культивирования составляла 0,1, 0,5, 1,0 мкг/мл.
2.7. Анализ липидной фракции
Анализ липидной фракции проводили спектрофотометрически в области длин волн
200- 310 нм на спектрофотометре Specord UV VIS "C. Ziess Jena" (Германия), а
также методом тонкослойной хроматографии [35, 191].
Разделение осуществляли в присутствии “свидетелей” на пластинках sorbfil
(Россия): тип сорбента – силикагель СТХ-1А, зернение – 5-17 мкм, размер – 100 х
200 мм.
Пластинки с силикагелем активировали при температуре 110-120°С в сухо – жаровом
шкафу в тече
- Київ+380960830922