<p>РОЗДІЛ 2<br />МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ<br /> Вибір осіб для цитогенетичного обстеження з числа дорослого і дитячого населення визначався задачами роботи. У залежності від інтенсивності і типу радіаційного впливу, обстежували три експоновані групи:<br />- пацієнтів, що перенесли гостру променеву хворобу (ГПХ) першого ступеня важкості в результаті аварії на ЧАЕС (модель гострого опромінення у високих дозах) - 11 чоловік, усі чоловіки віком від 27 до 42 років на момент аварії;<br />- ліквідаторів наслідків Чорнобильської аварії (НЧА) (модель пролонгованого опромінення в середніх і низьких дозах, що не перевищують 25сГр ) - 12 чоловік, усі чоловіки віком від 25 до 46 років на момент аварії ;<br />- дітей шкільного віку (30 чоловік, хлопчиків, дівчаток - 12 і 18 чоловік, обстежених з інтервалом у 1 рік), що мешкають у с. Виступовичі Овруцького району Житомирської області з щільністю забруднення ґрунту ізотопом 137Cs 14,9 Ku/км2 (модель хронічного опромінення в малих дозах).<br /> Як умовно контрольні групи обстежували практично здорових дітей (10 чоловік) віком від 9 до 15 років і дорослих (7 чоловік) віком від 20 до 40 років, що мешкають у м. Києві. <br /> У число обстежених включали осіб, що заперечували можливість свідомого контакту з відомими або передбачуваними мутагенами, за винятком іонізуючої радіації. Контрольні й експоновані групи підбирали ідентично з урахуванням статі, віку, відсутністю в 3-х місячному анамнезі інфекційних захворювань і прийому лікарських препаратів, а протягом останнього року - діагностичного рентгенівського опромінення.<br />2.1. Методика культивування лімфоцитів, готування і фарбування хромосомних препаратів<br /> Матеріалом цитогенетичного дослідження була венозна кров, отримана від осіб з вищевказаних груп у клініці НЦРМ (пацієнти, що перенесли ГПХ, ліквідатори НЧА) або на місці проживання в експедиційних умовах (діти).<br /> Кров гепаринізували з розрахунку 20 одиниць гепарину на 1 мл крові і зберігали в холодильнику до приготування культуральної суміші (не більше 24-х годин після забору проб крові). Перед постановкою культури лімфоцитів кров у флаконі ретельно перемішували. Лімфоцити культивували по загальноприйнятому напівмікрометоду Хангерфорда з модифікаціями, прийнятими в лабораторії цитогенетики Інституту експериментальної радіології НЦРМ АМН України (D.A. Hangerford, 1965; Н.П. Бочков, Н.П. Кулешов, 1971) [44, 45]. <br /> Всі етапи постановки культури лімфоцитів проводили в стерильних умовах. Культуральна суміш не містила антибіотиків і ембріональної телячої сироватки і складалася з наступних компонентів: 1 частина цільної венозної крові + 9 частин середовища Ігла чи RPMI 1640 (Sigma, США). Для стимуляції поділу лімфоцитів до 10 мл культуральної суміші додавали 0,02 мл фітогемагглютиніну (Difco "P", США). Культуру інкубували в термостаті при 37,5о С протягом 48-50-ти годин. Фіксація культури в ці терміни дозволяла досліджувати клітини, що знаходяться переважно в першому мітозі, що необхідно для об'єктивного обліку індукованих хромосомних аберацій (В.Д.Жестяников, 1977; М.А. Пилинская и др., 1991; Н.А. Мазник, В.А. Винников, 2002; И.Е. Воробцова, 2002; А.Ф. Захаров, В.А. Бенюш, 1982; Н.П. Бочков, Н.П. Кулешов, 1971; К. Бактон, Г. Эванс, 1975) [3 - 6, 34, 45, 148]. Для зупинки розподілу клітин на стадії метафази і нагромадження метафаз за 2 години до фіксації культури в кожну культуральну пробірку вводили колхіцин (Sigma, США) у кінцевій концентрації 0,5 мкг/мл. Після закінчення інкубації культуральну суміш зливали в центрифужні пробірки, центрифугували (5 хв. при 1000 об/хв.), видаляли надосадову рідину і проводили гіпотонічну обробку клітин. З цією метою осад обробляли нагрітим до 38о С приготованим ex tempore 0,075М розчином хлористого калію протягом 10 хвилин при 37о з розрахунку 1 мол гіпотонічного розчину на осад, отриманий з 1 мл культури). Потім суспензію центрифугували (5 хв. при 1000 об/хв.), видаляли надосадову рідину (залишаючи 0,3 мл її), суспендували осад у кількості гіпотонічного розчину, що залишилася, і фіксували свіжоприготованою охолодженою сумішшю етанолу і крижаної оцтової кислоти (3:1) із триразовою зміною фіксатора. Першу порцію фіксатора (8 мл) додавали при постійному струшуванні пробірки, осад суспендували у фіксаторі і залишали при + 4о С на 45-60 хв. Наступні зміни фіксатора проводили через 15-20 хв. Безпосередньо перед готуванням препаратів метафазних хромосом проводили останню зміну фіксатора. Для приготування препаратів хромосом 5-7 крапель клітинної суспензії наносили на вологе, охолоджене і знежирене скло, що потім підсушували на термостолику при + 45о С. Фарбування препаратів проводили 2% розчином барвника Гімза (Giemsa stain, Merk, Німеччина) протягом 10-15 хв. Препарати зашифровували.<br /> Для оцінки стабільності геному соматичних клітин в осіб, що постраждали в зв'язку з аварією на ЧАЕС (виявлення можливого адаптивного відгуку або експресування радіоіндукованої хромосомної нестабільності), проводили т.зв. тестуючий (проявляючий) мутагенний вплив - додаткову обробку отриманих культур мутагеном-провокатором (хімічним або радіаційним) in vitro.<br /> Як основний мутаген-провокатор вибрали речовину, що вивчалася нами раніше - етиленімінопохідне фосфорних кислот діматіф (диетиленімід амідотіофосфорної кислоти), що відноситься до алкілуючих сполук. Діматіф вводили в культуру лімфоцитів у кінцевій концентрації 0.4 мкг/мл на стадії G1 мітотичного циклу (через 2 години від початку інкубації) і залишали до кінця культивування. Через затримку мітотичного циклу в результаті дії діматіфу, експоновану культуру інкубували довше - протягом 53-х годин (до введення колхіцину). На відміну від дії іонізуючого випромінювання in vivo, що приводить до утворення в лімфоцитах аберацій хромосомного типу, діматіф індукує in vitro аберації переважно хроматидного типу, діючи на стадіях синтезу ДНК (S) і постсинтетичній (G2) стадіях клітинного циклу, що дозволяє розрізняти кластогенний ефект від обох досліджуваних факторів (А.В. Севанькаев, 2002; А.Ф. Захаров</p>
- Київ+380960830922