РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ та методи дослідження
2.1. Постановка експерименту
У роботі використовували щурів-самців популяції Wistar із масою тіла 150-180 г,
що утримувалися у віварії Харківського національного університету ім. В.Н.
Каразіна.
Тварини були поділені на групи залежно від завдання дослідження:
а) контроль – щури, яким вводили фізіологічний розчин (1 мл);
б) щури, яким вводили хлорид меркурію в дозі 0,7 мг/ 100 г маси тіла (LD50) та
декапітували через 0,5, 2, 24 та 96 год [252];
в) тварини, яким вводили хлорид кобальту в дозі 3 мг/ 100 г маси тіла (6/ 10
LD50), тварин декапітували через 2 та 24 год [253];
г) тварини, що отримували ін’єкцію пентоксифіліну в дозі 15 мг/ 100 г маси тіла
та декапітували через 4 год [254];
д) тварини, яким вводили пентоксифілін за 2 год до введення хлоридів меркурію,
кобальту, яких декапітували через 4 год від початку експерименту;
е) щури, яким вводили розчин хлориду кадмію у дозі 1,4 мг/ 100 г маси тіла (1/
10 LD50) та декапітували через 2 та 24 год [255].
Усі маніпуляції з тваринами проводили під хлоралозно-уретановим наркозом [256],
ін’єкції здійснювали внутришньочеревинно (рис. 2.1).
Хлорид меркурію (0,7 мг/ 100 г маси тіла)
або
Хлорид кобальту (3 мг/ 100 г маси тіла)
Пентоксифілін
(15 мг/ 100 маси тіла) Декапітація
Хлорид кадмію (1,4 мг/ 100 г маси тіла)
Хлорид кобальту (3 мг/ 100 г маси тіла)
Хлорид меркурію (0,7 мг/ 100 г маси тіла)
Рис. 2.1. Схема експерименту.
Пентоксифілін вводили за 2 год до ін’єкції хлоридів меркурію або кобальту,
декапітацію проводили через 4 год від початку експерименту для дослідження
брали різні тканини. Також виявляли дію хлориду меркурію у динаміці, для чого
вводили цю сіль на 0,5, 2, 24 і 96 год, та аналізували тканинні зміни. Вплив
хлоридів меркурію, кобальту, кадмію на субклітинні фракції виявляли через 2 і
24 год. Всі ін’єкції здійснювали внутрішньчеревинно.
2.2. Одержання гомогенатів органів і субклітинних фракцій
Після декапітації черевну порожнину анестезованої хлоралозно-уретановим
наркозом тварини розтинали, печінку перфузували холодним середовищем виділення
(0,25 М сахароза, приготовлена на 25 мМ трис-HCl, рН 7,5). Після перфузії
печінки її гомогенізували в гомогенізаторі Поттера на льоду з розрахунку 0,5 г
тканини на 4 мл середовища виділення. Нирки та серце промивали холодним
середовищем виділення, розтинали ножицями на дрібні шматочки й пропускали крізь
прес. Після чого гомогенізували в гомогенізаторі Поттера з розрахунку 0,5 г
тканини у 4 мл середовища виділення. Для дослідження продуктів ПОЛ у
гомогенатах тканин органів замість сахарозного використовували фізіологічний
розчин. Після отримання осаду субклітинних фракцій його ресуспендували у
фізіологічному розчині. Аорту вирізали, відмивали від крові, заморожували у
рідкому азоті та розтирали.
Субклітинні фракції печінки одержували шляхом диференційного центрифугування
гомогенатів на центрифузі MSЕ ROTOR LOG SHEET SUPERSPEED 65 [257]. Незруйновані
клітини та їх уламки одержували при 1000 g (R=8 см) упродовж 10 хв при 2 °С.
Ядра осаджували при 3000 g протягом 10 хв, супернатант використовували для
одержання фракцій важких мітохондрій (8300 g 10 хв) та легкої мітохондріальної
фракції (16300 g 20 хв), остання також містить лізосоми. Мікросоми отримували
шляхом центрифугування надосаду легкої мітохондріальної фракції при 105000 g 60
хв. Супернатант використовували як фракцію цитозолю. Субклітинні фракції
ресуспендували у 1 мл середовища виділення 3 рази.
Для одержання субклітинних фракцій з меншим ступенем забруднення отримані осади
надалі очищували [258-260]. Для цього осад ядер ресуспендували у буфері, що
містить 2,1 М сахарозу, 50 мМ трис-HCl (рН 7,4), 5 мМ MgSO4, нашаровували його
на таку саму забуферену сахарозу. Центрифугували при 70000 g 60 хв і збирали
осад. Ще раз проводили цю процедуру для одержання ядер.
Осад мітохондрій промивали 0,01 М К-фосфатним буфером (рН 7,4) для видалення
частини розчинних баластних білків і знову центрифугували при 8500 g протягом
15 хв.
Осад легкої мітохондріальної фракції ресуспендували у 45%-му (1,25 г/ мл)
ізоосматичному розчині метризаміду, нашаровували зверху розчини метризаміду 30,
26, 24 і 19% (1,16, 1,145, 1,135 і 1,105 г/ мл) і центрифугували 2 год при
97000 g. Лізосоми концентрувалися в шарі щільністю 1,105-1,135 г/ мл.
Осад мікросомальної фракції, забруднений у печінці підфракціями зернистих і
незернистих мембран, вільних полірибосом і рибосом, потім суспендували у
відповідному середовищі виділення.
У дослідження брали субклітинні фракції, забруднені не більше як на 10%.
2.3. Маркери субклітинних фракцій і методи їх визначення
Проводили оцінку чистоти отриманих фракцій, для чого визначали загальну
активність маркерних ферментів у вихідному гомогенаті й отриманому препараті
[261]. У дослідженні визначено активність г-глютамілтрансферази – маркера
плазматичної мембрани, цитохромоксидази – мітохондрій, кислої фосфатази –
лізосом, глюкозо-6-фосфатази – мікросом, лактатдегідрогенази – цитозолю. Для
підтвердження чистоти субклітинних фракцій також використані хімічні маркери:
DNA, що переважно міститься в ядрах і мітохондріях, сіалова кислота – у
плазматичній мембрані (рис. 2.2). Оцінено також співвідношення між окремими
фракціями ліпідів [258, 262].
2.3.1. Електрофорез дезоксирибонуклеїнової кислоти в агарозному гелі
Вміст DNA аналізували за допомогою горизонтального електрофорезу в 2%
агарозному гелі при кімнатній температурі 18-25 0С [263]. Для цього заливали в