РОЗДІЛ 2
Матеріали і методи досліджень.
Робота виконувалась на базі лабораторії клінічної імунології Українського
науково-практичного центру ендокринної хірургії, трансплантації ендокринних
органів і тканин МОЗ України за період з 2000 по 2004 роки.
На момент планування дисертаційної роботи було відомо, що в генезі цукрового
діабету 1-го типу (ЦД1) та 2-го типу (ЦД2) важливу роль відіграють одні і ті ж
чинники уродженої системи імунітету, а саме низка прозапальних цитокінів
макрофагального походження. Серед них нашу увагу привернули, зокрема, ТНФб та
ІЛв, тобто одні з основних цитокінів неспецифічної ланки імунітету. Паралельно
за обох типів діабету досліджувалися загальний стан лімфоїдного компартменту
специфічної системи імунітету та розподіл на периферії Тх1 і Тх2 клітин і вміст
в сироватці крові ІЛ-10 та ІЛ-12, відповідальних за направленість специфічної
імунної відповіді. Згідно зазначеного та для досягнення мети роботи
вирішувалися наступні задачі:
1. Дослідити вміст ТНФб, ІЛ-1в, ІЛ-10 та ІЛ-12 у периферичній крові осіб групи
ризику щодо розвитку цукрового діабету 1-го типу.
2. Визначити вміст ТНФб, ІЛ-1в, ІЛ-10 та ІЛ-12 у периферичній крові у хворих із
вперше виявленим цукровим діабетом 1-го типу.
3. Дослідити можливість визначення вмісту в периферичній крові прозапальних
цитокінів у якості маркерів перебігу аутоімунного руйнування в-клітин.
4. Дослідити вміст цитокінів (ТНФб, ІЛ-1в, ІЛ-10 та ІЛ-12) у хворих з вперше
виявленим цукровим діабетом 2-го типу.
5. Визначити характер зв’язку між рівнем цитокінів і станом метаболізму у
хворих на цукровий діабет 2-го типу.
6. Дослідити особливості розподілу основних популяцій лімфоїдних клітин та
субпопуляцій Тх1 і Тх2 лімфоцитів в периферичній крові хворих на цукровий
діабет 1-го та 2-го типів.
7. З’ясувати діагностичну та прогностичну цінність визначення цитокінів у
периферичній крові у хворих на цукровий діабет 1-го та 2-го типу.
2.1. Загальна характеристика хворих.
Згідно поставленим питанням обстежено 80 хворих на цукровий діабет 1-го типу та
45 хворих на цукровий діабет 2-го типу. Окрім цього, для формування групи дітей
і підлітків з ознаками схильності до захворювання діабетом обстежено група осіб
від 128 сімей, у яких зареєстровані випадки захворювання на цукровий діабет
1-го та 2-го типів. Внаслідок проведеного моніторингу відібрано 33 дітей і
підлітків з фенотипом DR3+, DR4+ та DR3+/DR4+ . У даної група осіб (перша
досліджувана група) у подальшому визначали вміст у периферичній крові таких
цитокінів, як IЛ-1в, ТНФб, IЛ-10, IЛ-12.
Другу досліджувану групу складали 80 хворих, серед яких - хворі з вперше
виявленим цукровим діабетом 1-го типу (ЦД1), хворі з терміном захворювання
меньше 1 року та хворі, з терміном захворювання від 1 року до 5. Із них у 61
особи в периферичній крові визначалася залишкова кількість С-пептиду, і вони
були віднесені до так званого С-пептид позитивного наявного цукрового діабету
1-го типу. У 10 осіб ознак синтезу власного інсуліну не визначалося, тобто вони
знаходилися у фазі С-пептид негативного цукрового діабет 1-го типу. Окрему
групу із 9 хворіючих склали діти, у яких було проведено визначення
субпопуляційного складу лімфоїдних клітин крові та Тх1 і Тх2 клітин. У якості
контролю при досліджені хворих на ЦД1 слугували здорові донори загальною
кількістю 40 осіб відповідного віку та статі.
Третя група складалася із 45 хворих з вперше виявленим цукровим діабетом 2-го
типу (ЦД2) з віковим інтервалом від 41 до 76 років та тривалістю захворювання
(по анамнестичним даним) від 0,5 місяця до 3 років. Із них у 27 хворих
визначалися усі параметри стану метаболізму та вмісту в периферичній крові
цитокінів. У 18 хворих, які склали окрему групу, проведено імунологічні
дослідження, а саме визначення субпопуляційного складу лімфоцитів та розподілу
Тх1 і Тх2 клітин. Контрольна група для цих досліджень представлена 27 відносно
здоровими донорами відповідного віку і статі. Загальниий об’єм проведеної
роботи наведено в таблиці 2.1.
Усі хворі на ЦД1 під час спостережень знаходилися на інтенсивній
інсулінотерапії. Хворим на цукровий діабет 2 типу призначали секретагог
інсуліну - репаглінід, відомий під фармацевтичною назвою НовоНорм (“Ново
Нордіск”, Данія). Механізм дії новонорму є достатньо вивченим. Він полягає у
взаємодії препарату зі специфічними рецепторами АТФ-чутливих калієвих каналів
на бета-клітинах острівців Лангерганса. Внаслідок їх блокади відбувається
деполяризація мембрани клітин, підвищується рівень цитозольного кальцію, що
викликає активацію екскреції інсуліну. При цьому рівень гормону в сироватці
крові максимально збільшується на короткий час (до 90 хвилин). Але головним є
те, що репаглінід не проявляючи екстрапанкреатичної дії [169, 170], не міг
прямо впливати на продукцію прозапальних цитокінів як жировими клітинами, так і
макрофагами. Доза новонорму підбиралася для кожного хворого індивідуально і
коливалася від 0,5 до 3,0 мг на прийом перед їжею.
2.2. Методи досліджень
2.2.1. Визначення DR3 та DR4 фенотипу
Дослідження поверхневого фенотипу лімфоїдних клітин визначали за допомогою
метода стандартного лімфоцитотоксичного тесту за Терасакі [171]. Для цього
використовували тест-панель типуючих сироваток виробництва РНДІ гематології та
трансфузіології (Санкт-Петербург), які відкривають специфічні локуси HLA-DR.
Мононуклеари виділяли за загальноприйнятим методом [172]. Антигени локусу
HLA-DR ідентифікували у пролонгованому тесті комплемент-залежної
лімфоцитотоксичності з попереднім збагаченням завису клітин В-лімфоцитами на
колонках з нейлоновою ватою.
Таблиця 2.1
Загальний об’