РОЗДІЛ 2
ВЛАСНІ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1.Матеріал і методи дослідження
Робота виконана на базі кафедри мікробіології, вірусології та біотехнології
Національного аграрного університету та НВП “Біо-Тест-Лабораторія ” (м. Київ).
Частину досліджень проводили на базі Центру з вивчення особливо небезпечних
хвороб тварин УААН (м. Житомир) та в тваринницьких господарствах (КСП
“Придніпровське”, с. Трипілля Обухівського району Київської області ) .
У процесі виконання роботи були використані штами вірусів, первинні та
перещеплювальні клітинні культури, а також різні види тварин: свині, вівці,
кози.
2.2.Штами вірусу КЧС
Штам ЛК-М – вакцинний, отриманий в умовах НВП “Біо-Тест Лабораторія” ( за нашою
участю) методом клонування вакцинного штаму ЛК-ВНДІВІМ, адаптований до КК ТЯ
(депонований у Державному науково-контрольному інституті біотехнології і штамів
мікроорганізмів м.Київ); штам Ші – Минь, отриманий у Центрі з вивчення особливо
небезпечних хвороб тварин (м. Житомир), вірулентний для свиней різного віку при
парентеральному зараженні.
2.3. Клітинні культури
Постійні лінії клітин РК-15 та SK-6, одержані від американської колекції
клітинних культур у вигляді моношару, адаптовані до місцевих живильних
середовищ ГЛА, RPMI. Зберігаються у замороженому стані
(- 196 0 С).
Первиннотрипсинізована клітинна культура з тканин тестикул ягнят, отримана за
загальноприйнятою методикою та власною модифікацією ряду елементів.
2.4. Методика одержання тестикулярної тканини
В умовах господарства відбирали баранчиків віком 1 – 4 місяці та кастрували їх
закритим способом. Тестикули із загальною піхвовою оболонкою поміщали в склянку
з підтримуючим середовищем RРМІ – 1640, охолодженим до 4 0 С, яке містило
антибіотики – стрептоміцину сульфат 2мг/см3 та бензил-пеніциліну 2000 ОД / см3.
Матеріал транспортували в лабораторію і піддавали трипсинізації.
Трипсинізацію здійснювали при різних температурних режимах (40С, 200С та 370С).
Використовували стандартний 0,25%-ний розчин трипсину. Під час трипсинізації у
флакон з шматочками тканини почергово вносили трипсин та живильне середовище
RPMI без сироватки крові. Така модифікація забезпечувала стабільний позитивний
результат під час отримання клітинної культури з тканин тестикул ( наша
модифікація ).
Після підрахунку кількості живих клітин одержували суспензію на ростовому
живильному середовищі (ГЛА / RPMI 50 / 50 з 10 % сироватки крові вівці),
доводили до концентрації 200 тис./ см3 та висівали в скляні або пластикові
матраси, ролерні флакони, 96 – лункові планшети фірми SARSTED (залежно від
потреб). Інкубували в стаціонарних та ролерних умовах 1-2об./хв при температурі
370 С. Стан формування моношару клітин визначали візуально та за допомогою
інвертованого мікроскопа Оpton – ID – 02.
Моношар клітин формувався, як правило, протягом 72 – 96 годин. У дослідах
використовували планшети, матраси з якісним суцільним моношаром клітин.
Методика отримання первинної клітинної культури з тканин тестикул козлика була
аналогічною. Відпрацьовувались оптимальні прийоми, живильні середовища, умови
культивування.
2.5. Методика зараження клітинних культур
Зараженню підлягали лише зразки клітинних культур із суцільним якісним
моношаром. При зараженні живильне середовище зливали, у кожний матрас з
культурою (об'ємом 1000см3 ) вносили по 10см3 культуральної вірусвмісної
рідини, яку розподіляли по всьому шару клітин. Адсорбцію вірусів здійснювали
протягом 30-45 хвилин при кімнатній температурі (18-250С). Після цього в кожний
матрас (1,5дм3) з інфікованою культурою вносили по 200см3 живильного середовища
(ГЛА або Ігла на основі ФГМ-С з 4 % сироватки вівці або ягнят ), рН 7,5-7,6.
Матраси з інфікованою культурою клітин поміщали в термостат при температурі
370С. Через 4-5 діб усі матраси з інфікованою культурою клітин мікроскопували
та зберігали при температурі не вище мінус 300С.
У зв?язку з пошуком методу зараження клітинних культур, який забезпечував би
найбільш високу врожайність вірусного штаму та був би технологічним, зараження
клітин здійснювали за різними варіантами :
з попереднім відмиванням моношару та без відмивання;
із застосуванням процедури “адсорбція” вірусу та шляхом безпосереднього
внесення вірусу в ростове живильне середовище.
Досліджували також вплив інших елементів на врожайність вірусу: інфікуючої
дози, присутності трипсину у підтримуючому середовищі, експозиції
культивування. Інфікована вірусом КЧС культура клітин ТЯ під мікроскопом з
утворенням бляшок в місцях локалізації вірусу показана на рис.2.1.
Рис.2.1.Первиннотрипсинізована культура клітин ТЯ, інфікована вірусом КЧС.
2.6. Методика отримання сироватки крові овець
Для одержання сироватки крові відбирали клінічно здорових тварин віком 6-8
місяців, визначали їх основні фізіологічні показники: температуру тіла, пульс,
дихання, стан слизових оболонок та інші.
При відборі крові тварину-донора клали на стіл або піддон заввишки 60-70см, для
зручності роботи оператора. Заздалегідь з правого боку, у верхній третині шиї,
вистригали ділянку площею 5-7см2. Визначали місце пульсації яремної вени,
звідки й відбирали кров за допомогою системи ВК-10-01 (рис. 2.2.), дотримуючись
правил асептики та септики.
Рис.2.2. Система ВК-10-01
Система ВК-10-01 складається з двох пластикових еластичних трубок (рис.2.2. А,
Б). Перша трубка має дві ін'єкційні голки, одну – для взяття крові з вени, іншу
- для з'єднання зі стерильним флаконом. Друга трубка містить ватний фільтр та
ін'єкційну голку, через яку витісняється повітря з флакона витікаючою кров'ю,
що надходить.
Від однієї тварини кров відбирали у кількості 200-300 см.3 П