ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Объекты исследований
В экспериментах были использованы эритроциты свежей и консервированной крови
человека. Донорскую кровь 1 и 2 группы, заготовленную на консерванте Глюгицир,
получали на Харьковской областной станции переливания крови. Клетки трижды
отмывали 10-кратным объемом физиологического раствора (150 мМ NaCl, 10 мМ
трис-HCl, рH 7,4 ) (раствор TBS) или (150 мМ NaCl, 5 мМ HEPES, рH 7,4) (раствор
HBS) центрифугированием на центрифуге ОПН-3 при 3000 об/мин в течении 3 мин. Из
свежей крови эритроциты человека получали добавляя несколько капель крови
донора к 10 мл физиологического раствора (150 мМ NaCl, 10 мМ Трис-HCl, pH 7,4),
перемешивали и дважды отмывали путем центрифугирования (3000 об/мин, 3 мин).
Плазму, лейкоцитарную пленку и надосадок удаляли аспирацией. Упакованный осадок
эритроцитов хранили при 4°С и использовали в течении 3-4 часов. 30 мкл
полученного осадка эритроцитов разводили в 0,5 мл физиологического раствора и
использовали как сток-суспензию.
2.2. Измерения концентрации белков в плазме крови.
Концентрацию белков в плазме измеряли фотометрическим способом, описанным в
[13] используя альбумин в качестве стандарта.
2.3. Регистрация динамики гемолиза эритроцитов методом светорассеивания.
Для регистрации динамики гемолиза эритроцитов в работе была использована
установка для измерения светорассеяния клеточных суспензий, созданная на базе
монохроматора спектрофотометра СФ-4А. Точность измерения оптического плотности
(ОП) не менее 0,001 Б. Динамику гемолиза эритроцитов измеряли на длине волны
720 нм при расходимости светового пучка 3 градуса. В кювету с изотоническим
раствором (2 мл) при постоянном перемешивании вносили 6-10 мкл суспензии клеток
(время перемешивания 2 с) таким образом, чтобы начальная величина ОП составляла
0,12-0,13, что соответствует концентрации эритроцитов в кювете порядка ~0,8Ч106
клеток в 1 мл, определенной на анализаторе Sysmex 2000 (Япония).
Аликвоты пептидов из концентрированных растворов добавляли в кювету с клетками
или без них. Оптическая плотность клеточной суспензии в указанном диапазоне
прямо пропорциональна количеству интактных клеток, так как на длине волны 720
нм светорассеяние теней, образующихся в процессе лизиса клеток, и поглощение
света гемоглобином пренебрежимо мало [135]. Вследствие этого измеряемая
скорость изменения ОП пропорциональна скорости гемолиза [12, 195].
Скорость гемолиза рассчитывалась из кинетических кривых как (tga), где a - угол
между линейной частью кривой ОП и осью времени. ОП лизированной суспензии
клеток при данной длине волны, практически, равна нулю. Все эксперименты
проводили при комнатной температуре (20-22 °C). При перемешивании клеточной
суспензии регистрируются флуктуации светопоглощения, причем средняя амплитуда
этих флуктуаций для сферулированных эритроцитов равна нулю и возрастает по мере
увеличения степени дискоидности [105, 10]. Таким образом, выделяя и оценивая
постоянную и переменную компоненты сигнала, можно независимым образом
регистрировать как динамику изменения формы эритроцитов, так и динамику
гемолиза.
2.4. Измерение объема и концентрации эритроцитов методом спектроскопии
импульсов сопротивления (СИС).
Распределение по объему и концентрацию эритроцитов измеряли на
электроцитоанализаторе ЭЦА-1 (ИПКиК НАН Украины), являющимся аналогом счетчика
типа Counter Coulter, принцип действия которого основан на регистрации
импульсов тока, которые возникают при изменении клеткой сопротивления датчика.
Основы техники СИС изложены в работах [19, 187, 188]. Амплитуда импульсов
сопротивления представлялась в виде гистограммы (256 каналов), модальное
значение и другие характеристики которой рассчитывались компьютером.
Использовали цилиндрическое отверстие длиной и диаметром равным 50 мкм и
систему трансдюсера, обеспечивающего практически полную гидродинамическую
фокусировку клеток. Средняя линейная скорость потока жидкости через отверстие
не превышала 1 м/с. В каждом экспериментальном цикле анализировалось 215
клеток, при этом ток через отверстие не превышал 0,2 мА, и, таким образом, ни
электрического пробоя мембран [187], ни их значительной деформации не
происходило [188]. Калибровку прибора осуществляли с помощью латексных частиц
известного объема и эталона, которым служили сферулированные и зафиксированные
раствором 1%-го глутарового альдегида эритроциты. Таким образом, метод
обеспечивает измерение объема эритроцитов и их теней в суспензии.
Дополнительно параметры эритроцитов (средний объем, среднее содержание
гемоглобина, гематокрит, ширина распределения эритроцитов по объему) измерялись
на гематологическом анализаторе Sysmex 2000 (Япония) после их той или иной
обработки. Отличие от стандартного хода измерений для этого прибора состояло в
том, что к 10 мл изотонического раствора Sysmex добавляли 0,06 мл клеточной
суспензии с концентрацией 1,5Ч109 кл/мл., вместо 0,02 мл цельной крови,
согласно инструкции к прибору.
2.5. Получение гипотонических и гипертонических теней.
Мембраны теней готовили из эритроцитов крови, полученной из банка крови.
Для приготовления гипотонических теней 0,05 мл упакованных клеток инкубировали
в 0,5 мл гипотонического раствора NaCl (50 мМ NaCl, 10 мM Tris-HCl, pH 7.4) в
течение 1 мин при 0°C с последующим восстановлением изотонии путем добавления
10 мл холодного TBS и центрифугированием (4000ґ g, 10 мин).
В результате постгипертонического гемолиза были получены два типа
гипертонических теней.
1) - 100 мкл упакованных эритроцитов помещали в 1 мл 1,5 М раствора NaCl, 5 мМ
фосфатный буфер, рН 7,4 при 37°С и инкубировали 15
- Київ+380960830922