Розділ 2. МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Обгрунтування критеріїв вибору віку та статі експериментальних тварин
Експериментальні дослідження проведені на 269 білих безпорідних лабораторних щурах, з них: 98 статевозрілих самців віком 3 місяці з середньою масою тіла 180,2±3,464г, 81 статевонезрілих самців віком один місяць з середньою масою тіла 48,59±0,978г, 90 статевонезрілих самиць віком один місяць з середньою масою тіла 48,99±0,905кг. Обрані вікові групи суттєво відрізняються за ступенем зрілості нейрогуморальних механізмів реагування та адаптації до екзогенних стресорних чинників, у тому числі до гіпоксії та змін фотоперіоду. У ході онтогенезу дозрівання ГГНС детерміноване генетичною програмою і реалізується за принципом випереджуючого розвитку, згідно якого об'єднання периферійних та центральних її ланок відбувається послідовно по мірі утворення прямих та зворотних зв'язків. Найбільш чутливою ГГНС щурів до зовнішніх чинників є у пізньому неонатальному, коли гормональні впливи направлені головним чином на процес інактивації стресорної відповіді та зміни механізмів зворотного зв'язку [88]. Функціональна зрілість адаптаційних механізмів тісно пов'язана з формуванням та дозріванням окремих медіаторних систем нейро-імуно-ендокринної регуляції. Ці процеси в одномісячних тварин не завершені, що зумовлює особливості реагування на зовнішні чинники [137,138].
Відомо, що однією з особливостей реагування щурів на дію стресорів є статевий диморфізм, який особливо чітко проявляється у стрес-індукованій секреції катехоламінів та глюкокортикоїдів [139]. Адаптивні системи жіночих особин більш чутливі, динамічні, надійні, економічні й володіють більшою резервною потужністю, ніж у самців [140]. Естрогени не лише беруть участь у забезпеченні розмноження, а й впливають на більшість органів та систем, у тому числі й на функцію ГГНС [118]. Самиці під впливом емоційного стресу виділяють кортикостерон у більших кількостях, ніж самці. При цьому, підвищена адренокортикальна чутливість у самиць поєднується з можливістю нарощування інтенсивності стероїдогенезу при триваючому стресі, що не характерно для самців [132]. Самці менш стійкі до гострих та хронічних стресів, пов'язаних з геохімічними особливостями регіонів, зокрема до екзогенної гіпоксії та зміненої тривалості фотоперіоду [20]. Показано, що самці та самиці по різному реагують на короткочасну зміну фотоперіоду, що в кінцевому рахунку визначає різну швидкість адаптації до тривалої зміни фотоперіоду [128]. Результати окремих досліджень показали, що інтенсивність утворення продуктів ПОЛ та активність антиоксидантних ферментів у сироватці крові самців і самиць відрізняється за фізіологічних умов [130]. Статеві відмінності в реагуванні на стресорні чинники, у тому числі й окисний стрес, виявлені вже у новонароджених та в щурів у пізньому неонатальному онтогенезі [125,141,142].
Таким чином, підбір груп тварин за наведеними віковими та статевими критеріями дозволяє виявити відмінності у реагуванні на тривалу поєднану дію гіпобаричної гіпоксії та зміненого фотоперіоду.
2.2. Обгрунтування моделі гіпоксичного впливу та змін фотоперіоду
Для вирішення поставлених у роботі завдань застосована гіпобарична гіпоксія та змінений фотоперіод.
Зміни фотоперіоду моделювали шляхом запровадження штучних режимів освітлення. Постійне освітлення створювали шляхом цілодобового рівномірного освітлення інтенсивністю 500 лк кліток з тваринами за допомогою люмінесцентної лампи денного світла потужністю 20 Ват, у тому числі й під час сеансів гіпоксії. Постійну темряву створювали у спеціально обладнаному приміщенні, в якому клітки з тваринами утримувалися цілодобово, у тому числі й під час сеансів гіпоксії. Спостереження за тваринами під час цих сеансів та щоденний догляд за тваринами проводилися за слабкого (2 лк) червоного світла, яке не пригнічує вироблення епіфізом мелатоніну. За зміненого режиму освітлення тварини перебували протягом 8 діб від початку спостереження до моменту евтаназії, оскільки відомо, що за такий період постійне освітлення практично повністю пригнічує продукцію мелатоніну епіфізом. Змінений режим освітлення запроваджували за добу до початку сеансів гіпоксії, таким чином він виступав у ролі дезадаптуючого чинника в процесі адаптації до гіпоксії [101].
Результати чисельних досліджень показали, що експериментальна гіпоксія є унікальною біологічно адекватною моделлю, що дозволяє вивчати закономірності перебудов як системних, так і автономних органних механізмів регуляції в організмі людини за точно дозованих змін основного фактора життя - вмісту кисню в навколишньому середовищі [5]. Для створення гіпобаричної гіпоксії використана власна оригінальна модель, яка є фізіологічною і певною мірою наближена до природних умов киснепостачання у високогірних регіонах з постійним проживанням людей і тварин.
Гіпобарична гіпоксія створювалася у проточній прозорій скляній гермокамері, через стінки якої можна спостерігати за піддослідними тваринами та змінювати ступінь освітлення. Повітря відсмоктували з нижньої частини гермокамери з допомогою вакуумного компресора. Через отвори у верхній частині у камеру надходило повітря ззовні. Ступінь розрідження повітря у гермокамері вимірювали вакуумметром, вмонтованим у вакуумний відсмоктувач. Різниця діаметрів приточного та відточного отворів дозволяла створювати та підтримувати протягом тривалого часу в камері барометричний тиск, що на 0,4 атм нижче за атмосферний тиск, тобто розрідження повітря в камері відповідало тиску на висоті 4000 м над рівнем моря (460 мм рт. ст.). Парціальний тиск кисню в повітрі на такій висоті складає 97 мм рт. ст., тобто 61% від цього ж показника на рівні моря, напруга кисню в артеріальній крові складає 57-61%, а у венозній - 75-90% від показників на рівні моря [14]. Швидкість зміни барометричного тиску складала 0,5 мм рт. ст./с, що відповідало швидкості "підйому" на задану висоту 24 км/год. За обраної швидкості "підйому" не спостерігали летальних наслідк