РАЗДЕЛ 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Объектом исследования служили эякуляты человека при нормоспермии. В эксперимент бралась сперма соответствующая следующим показателям (табл. 2.1.):
Таблица 2.1.
Показатели эякулята при нормоспермии используемые в этой работе (ВОЗ, 1999 г.).
ПоказательЗначениеОбъем2- 6 млpH7,2 - 8,0Время разжижения20 - 40 минКонцентрация спермиев 20 млн. и болееКоличество спермиев в эякуляте 40 млн. и болееПодвижность спермиев в группах:
а) с быстрым поступательным движением (активноподвижные)
20 - 25 %b) с медленным разнонаправленным движением (подвижные)25 % и болеес) с колебательным движением (местнокачающиеся)Не более 25 %Жизнеспособных75% и более% нормальных (по морфологии) спермиев30 % и болееЛейкоциты и клетки сперматогенеза ?круглые клетки?Не более 6 млн. в млАгглютинаты < 3-х в поле зрения 2.1. Методы микроскопических исследований
Исследования проводили с помощью светового микроскопа "Biolar" с увеличением 200, 400 и 1000. Качество спермы определяли путём анализа подвижности, концентрации и морфологических параметров. Концентрацию и подвижность спермиев определяли при помощи счётной камеры Маклера (Makler counting chamber, Израиль) при увеличении 200. Для определения подвижности каплю неразведенного эякулята помещали в центр камеры и быстро накрывали специальным покровным стеклом. Таким образом в камере создавался монослой клеток и подсчитывалось количество прогрессивно подвижных (с быстрым поступательным движением) и подвижных (с медленным разнонаправленным движением) спермиев (а + b) в 10 квадратах по диагонали. Процедуру повторяли несколько раз, подвижность выражали в процентах. Для определения концентрации сперму инактивировали в водяной бане при 50 - 60оС, подсчёт производился в 10 квадратах по диагонали, что соответствовало концентрации клеток 106/мл, согласно спецификации счётной камеры.
Время переживаемости определяли при температуре 37°С и выражали в часах до полной остановки движения 90 % спермиев.
2.2. Биохимические методы
Определение концентрации молочной кислоты осуществляли ферментативным методом по накоплению никотинамидадениндинуклеотида восстановленного (НАДН) в системе сопряжённых ферментативных реакций [20].
Оптическую плотность измеряли с помощью спектрофотометра Shimadzu QV-50 (Япония) при длине волны 340 нм. Содержание молочной кислоты выражали в ммоль/л.
Об интенсивности процессов ПОЛ судили по активности СОД, накоплению ТБК-активных продуктов и содержанию диеновых и триеновых конъюгатов.
Концентрацию малонового диальдегида (МДА) определяли по интенсивности окраски, образовавшейся в ходе реакции МДА и ТБК, протекающей в кислой среде при высокой температуре [115]. Образовавшийся в результате реакции триметиновый комплекс, содержащий одну молекулу МДА и две молекулы ТБК, имеет характерный спектр поглощения с максимумом при длине волны 535 нм.
Определение диеновых и триеновых конъюгатов в эякуляте осуществляли модифицированным методом Плацера с соавт. (1976) [20]. Принцип метода основывается на установлении содержания первичных продуктов ПОЛ в биологической жидкости по поглощению липидным экстрактом монохроматического светового потока в ультрафиолетовой области спектра при длинах волн 233 и 278 нм. Для выражения полученного результата в единицах абсорбции на 1 мл эякулята (ед. А/мл) из абсорбции опытной пробы вычитают таковую контрольной и полученное значение удваивают.
Активность СОД в эякуляте определяли по восстановлению красителя нитросинего тетразолия (НСТ) [159]. Для этого в контрольную пробу вносили 0,2 мл 1 ммоль/л раствора ЭДТА, 0,1 мл 1 % раствора желатина, 0,5 мл 24 ммоль/л раствора НСТ, 1 мл 0,03 ммоль/л раствора феназинметасульфата (ФМС) и доводили объём инкубационной пробы до 3 мл. В опытную пробу дополнительно вносили эякулят. В контрольной и опытной пробах реакцию запускали добавлением 0,1 мл 1 ммоль/л раствора НАДН. Инкубацию осуществляли в течение 10 мин при 25?С в аэробных условиях. Через 10 мин измеряли величину оптической плотности при 540 нм. Активность СОД выражали в условных единицах, и за 1 у.е. принимали 50 % ингибирования окислительно-восстановительной реакции.
Общую антиоксидантную активность определяли в модельной системе суспензии желточных липопротеидов (ЖЛП). Для этого суспензию ЖЛП гомогенизировали в равном объёме фосфатного буфера (40 ммоль/л КН2РО4, 105 ммоль/л КCl, рН 7,4). Анализ проводили следующим образом. К 1 мл суспензии ЖЛП добавляли 0,5 мл эякулята и 7 мл фосфатного буфера. ПОЛ во всех пробах инициировали добавлением 1 мл 25 ммоль/л FeSO4 * 7 H2O. Пробирки инкубировали при 37?С в течение 15 минут при интенсивном перемешивании. Скорость ПОЛ определяли по количеству накопленных в образце ТБК-активных продуктов. После инкубации отбирали по 2 мл из каждой пробы, добавляли по 1 мл 20 % ТХУ и 0,1 мл 0,01 моль/л раствора ионола в этаноле. Затем содержимое пробирок перемешивали и центрифугировали 15 мин при 900 g. К 2 мл супернатанта добавляли 1,8 мл раствора, содержащего 0,5 % ТБК в 0,3 % додецилсульфата натрия. Смесь инкубировали в кипящей водяной бане 15 минут. Пробирки охлаждали, добавляли по 2 мл хлороформа и после интенсивного встряхивания центрифугировали при тех же условиях. В водной фазе измеряли оптическую плотность контрольной и опытной проб против нулевой пробы при длине волны 532 нм. Нулевая проба содержала фосфатный буфер и раствор FeSO4. Общую антиоксидантную активность выражали в процентах от ингибирования 50 % ПОЛ в модельной системе по сравнению с классическим антиоксидантом ионолом.
2.3. Метод гипотермического хранения спермиев
Средой хранения спермиев служила семенная плазма и раствор Хенкса. Гипотермическими условиями были охлаждение суспензии клеток от комнатной температуры до 10?С в стеклянных пробирках при открытом доступе кислорода, помещая их в холодильник. Отогрев после гипотермии осуществляли в термостате при 37?С на воздухе.
2.4.