РОЗДІЛ 2
ОБ’ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Відбір тварин для дослідження
З метою реалізації поставлених завдань проведено досліди на 240 білих
нелінійних щурах-самцях масою 0,14-0,18 кг. Вибір цього виду піддослідних
тварин зумовлений тим, що в них характер ураження печінки й нирок хімічними
агентами, особливо морфологічні зміни, близькі до тих, що виникають у людей.
Тварин утримували в віварії Тернопільського державного університету імені
І.Я.Горбачевського. Годування щурів проводили відповідно до норм інституту
харчування АМН України, призначених для даного виду тварин (Наказ МОЗ СРСР №
1179 від 10 жовтня 1983 року - «Об утверждении нормативов затрат кормов для
лабораторных животных в учреждениях здравоохранения»). Догляд за тваринами та
всі маніпуляції проводили у відповідності з положенням «Європейської конвенції
про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та
інших наукових цілей» (Страсбург, 1986 р.), а також «Загальних етичних
принципів експериментів на тваринах», ухвалених першим національним конгресом з
біоетики (Київ, 2001р.) та вимог додатку до «Правил проведення робіт з
використанням експериментальних тварин», затверджених наказом Міністерства
охорони здоров’я № 755 від 12 серпня 1977 р. «Про заходи щодо подальшого
удосконалення організаційних форм роботи з використанням експериментальних
тварин». Комісією з питань біоетики Тернопільського державного медичного
університету (протокол № 11 від 2006 р.), порушень морально-етичних норм при
проведенні науково-дослідної роботи на експериментальних тваринах не виявлено.
Всі піддослідні тварини були поділені на такі групи: 1 – контроль (28 тв.), 2 –
ССl4 (24 тв.), 3 – етиленгліколь (24 тв.), 4 – ССl4+етиленгліколь (24 тв.), 5–
ССl4+етиленгліколь+полісорб (28 тв.), 6 – ССl4+етиленгліколь+ “Селен-хелат” (28
тв.), 7–ССl4+етиленгліколь+есберітокс (28 тв.), 8–
ССl4+етиленгліколь+“Селен-хелат”+есберітокс+полісорб (28 тв.), 9–
тетрахлорметан + етиленгліколь + легалон (28 тв.).
Модель експериментального токсичного ураження тетрахлорметаном викликалася за
допомогою підшкірного введення токсиканта у дозі 4 мл/кг у вигляді 50 % розчину
на рослинній олії щоденно протягом чотирьох діб [95, 160, 237]. Токсичне
ураження етиленгліколем викликали шляхом введення 1 % розчину його протягом
семи діб з питною водою [20, 21, 77, 238]. Комбіноване ураження
тетрахлорметаном і етиленгліколем моделювали шляхом уведення тваринам
тетрахлорметану підшкірно в дозі 4 мл/кг у вигляді 50 % розчину на рослинній
олії щоденно протягом чотирьох діб і з тієї ж самої доби 1 % розчину
етиленгліколю з питною водою протягом семи діб, що призводить до виражених
патологічних змін у печінці і нирках з порушенням їх фільтраційної та
реабсорбційної функції. Дослідження проводили на восьму добу.
Як засоби корекції токсичних уражень тетрахлорметаном і етиленгліколем
використовували полісорб (порошок для суспензії по 12 г, Джанкойсько-Сивашський
ДЕЗ, АР Крим, Україна) [42, 81], який вводили внутрішньошлунково у вигляді
водної суспензії, селеновмісний препарат «Селен-Хелат» (APOZEMA, Німеччина) у
дозі 50 мг/кг з третьої по сьому доби експерименту внутрішлунково у вигляді 1 %
крохмальної суспензії [223, 245]. Імуномодулюючий засіб – настойка кореня
ехінацеї пурпурової (ESBERITOX) (Schaper & Brummer, Німеччина) вводилась у дозі
20 мл/кг маси тварини інтрагастрально з третьої по сьому добу досліду [125,
181, 255]. Комбіноване введення препаратів проводили за наступною схемою:
полісорб у дозі 500 мг/кг внутрішньошлунково зондом з четвертої по сьому добу
експерименту за 3 год до уведення препарату селену та есберітоксу,
«Селен-хелат» у дозі 50 мг/кг з четвертої по сьому добу експерименту
внутрішньошлунково зондом через 3 год після уведення полісорбу, есберітокс у
дозі 20 мг/кг внутрішньошлунково зондом з четвертої по сьому добу експерименту
разом із препаратом селену. Гострі досліди проводили через 24 год після
останнього введення корегувальних агентів. Евтаназію проводили пiд легким
ефiрним наркозом.
Матеріалом для дослідження були крові, гомогенати печінки й нирок, сеча.
Визначали активність ферментів, інтенсивність перекисного окиснення ліпідів,
стан антиоксидантної системи, стан гуморального імунітету та стан ендогенної
інтоксикації, вміст креатиніну й сечовини в крові та сечі. Оцінювали також
морфологічні зміни в тканині печінки і нирок за допомогою світлової
мікроскопії. Сума цих показників дозволяє адекватно оцінити стан печінки та
нирок, а також своєчасно виявити появу, розвиток, регресію і важкість
патологічного процесу в них, як і ефективність лікувальних засобів.
2.2. Визначення активності АлАТ
Активність АлАТ в сироватці крові визначали за методом Reitman i Frankel [89].
Принцип методу базується на визначенні щавелевооцтової та піровиноградної
кислот, які є субстратами реакцій трансамінувння за участю АлАТ. В пробірку
вносили 0,5 мл субстратно-буферного розчину для визначення АлАТ, нагрівали його
на протязі 5 хв при 37 оС, добавляли 0,1 мл сироватки і інкубували 60 хв при
температурі 37 оС, після чого додавали 0,5 мл 2,4-динітрофенілгідразинового
розчину і витримували на протязі 20 хв при кімнатній температурі. Припиняли
реакцію внесенням у пробу 5 мл розчину NaOH з молярною концентрацією 0,4
моль/л. Через 15 хв. проби колориметрували на спектрофотометрі СФ-46 при 545 нм
в кюветі довжиною 10 мм проти холостої проби. Холосту пробу готували аналогічно
дослідним, але сироватку (гомогенат) вносили після інкубації. Розрахунок
активності ферменту