РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Методи дослідження обміну ліпідів та оцінки типу дисліпопротеїнемій
Вміст загального ХС визначали методом спектрофотометрії з використанням наборів реактивів ЧНПП "Філісіт діагностика", Дніпропетровськ. Наявність ХМ та ХС-ЛПДНЩ визначали методом візуалізації проби після експозиції плазми крові при температурі 0°-+4° С, концентрацію ХС-ЛПНЩ за методом Бурштейна та Самай [107], концентрацію ХС-ЛПВЩ з використанням набору реактивів фірми "Cormay", ТГ з використанням набору реактивів "Лахема", Чехія .
Верифікацію фенотипів щодо ДЛП проводили відповідно до методичних рекомендацій з діагностики серцево-судинних захворювань [148].
Про інтенсивність ПОЛ судили за концентрацією МДА, яку визначали за реакцією з тіобарбітуровою кислотою [148].
2.2. Вивчення функціонального стану тромбоцитів
Для дослідження стану Тр ланки гемостазу досліджували адгезію, аденозиндифосфат (АДФ)-агрегацію Тр периферичної крові у багатій тромбоцитами плазмі. Підрахування Тр проводили за допомогою лічильної камери Горяєва. Визначали також час АДФ-агрегації [23]. Досліджували ступінь максимальної агрегації (виражену у відсотках різницю між вихідною кількістю Тр, яку приймали за 100 %, і кількістю Тр через 10 хв після внесення до проби розчину АДФ); ступінь адгезії Тр (відмінність між вихідною кількістю Тр та кількістю Тр після контакту зі склом в умовах ротації на електромагнітній мішальці упродовж 5 хв) [153].
У хворих на ХНЗЗ СО визначали також вміст ФВ, що міститься в бідній Тр плазмі з використанням формалінізованих Тр донорів за методом Evans et Osten в модифікації О.А. Цигулєвої [119].
Принцип методу полягае в тому, що визначається вплив ФВ, що досліджується, на агрегацію відмитих та фіксованих формаліном Тр здорових осіб під впливом ристоцетину. Кількісне визначення проводять по кривій розведення нормальної змішаної безтромбоцитарної плазми. В основі методу полягає той факт, що Тр, оброблені слабим розчином формаліну, зберігають здатність до ристоцетин - агрегації (при наявності в середовищі ФВ), але не піддаються іншим видам агрегації (спонтанна, під впливом АДФ, адреналіну, тромбіну та ін.).
Реактиви:
1. 3,8 % розчин цитрату натрію;
2. Буферний розчин ( рН 7,6; 2 = KH2 PO4; 8 02 NaCl, 8,8 = Na2HPO4 розчинений в 1 літрі дистильованої води );
3. Буферований ЕДТО (етилендіамінотетраоцтова кислота) - формаліновий розчин: 3мл 0,007 М (0,483%) ЕДТО, 5 мл 4% розчину формаліну, 2 мл фосфатного буферу, 10 мл дистильованої води;
4. ЕДТО - буферний розчин : 0,77 М ЕДТО (1 частина) з фосфатним буферним розчином (49 частин);
5. Розчин ристоцетину ( 10 мг на 1 мл фосфатного буферу).
Приготування зависі відмитих фіксованих Тр здорових людей: 9 частин венозної крові донорів змішують з 1 частиною ЕДТО - формалінового розчину; в який кров вводиться безпосередньо з пункційної голки. Центрифугують протягом 5 хв при 1500 об/хв, отримують багату Тр плазму, в якій може бути виражений гемоліз. З цієї плазми отримують бідну Тр плазму центрифугуванням 20 хв при 4000 об/хв. Бідну Тр плазму видаляють, а Тр осад відмивають двічі ЕДТО - буферним розчином ( 4 - кратним об'ємом з центрифугуванням кожного разу протягом 10 хв при 4000 об/хв). Буфер, що містить ЕДТО, видаляють відсмоктуванням, а Тр осад розводять в буферному розчині без ЕДТО так, щоб в 1 мкл містилося біля 200 000 Тр.
Концентрація нормальних Тр: нормальні формалізовані тромбоцити можуть бути законсервовані з тим, щоб кожного разу не готувати їх знову. Для цього після відмивання ЕДТО - буферним розчином (двічі) їх поміщають в фосфатний буфер ( рН 7,4 ) з 0,01% розчином азиду натрію.
Завис розфасовують по 3 мл в стерильні флакончики, закатують та зберігають в морозителі (при -10 -12 ?С) протягом 2-3 міс. При необхідності вміст флаконів розморожується, Тр відмиваються двічі від консервуючого розчину буфером без ЕДТО та використовуються в тесті.
Приготування безтромбоцитарної плазми досліджуваного. Кров забирають з вени в умовах сіліконування та змішують з 3,8% розчином цитрату натрія (9:1). Центрифугують 7 хв при 1500 об/хв. Знімають багату Тр плазму, яку центрифугують 20 хв при 4000 об/хв. Бідну Тр плазму переносять в іншу сіліконовану або пластикову пробірку та використовують в тесті.
Хід дослідження.
В 2 кювети для ФЕК з робочою гранню 5,65 мм та об'ємом 2,5 мл вводять по
1 мл зависі відмитих нормальних Тр, 0,4 мл безтромбоцитарної плазми досліджуваного та 0,4 мл буферу без ЕДТО.
В кювету з контролем вводять 0,6 мл буфера. Обидві кювети поміщають в ФЕК та при ? = 630 нм встановлюють стрілку ФЕКу на " О" в кювету з досліджуваною пробою, вводять 0,2 мл розчину ристоцетину, перемішують, включають секундомір. Через 2 хв реєструють зміни оптичної щільності досліджуваної проби, які пов'язані з агрегацією Тр під впливом ристоцетину.
Побудування кривої розведення.
Для кількісної оцінки наявності ФВ в досліджуваній плазмі користуються стандартною кривою розведення, отриманою від великої групи здорових молодих осіб нормальної безтромбоцитарної плазми. Цю плазму розводять буфером без ЕДТО від 1:2 до 1:32, після чого в кожну пробу вводяться відмиті нормальні Тр за вказаною вище методикою визначається ристоцетин - агрегація Тр. За точку підрахунку приймається те розведення плазми, при якому ристоцетин вже не викликає агрегації тромбоцитів. Ця точка відповідає 2 - 3% -ній наявності в середовищі фактора Віллебранда. Отримані дані наносяться на логарифмічний папір. При правильному побудуванні крива в білогарифмічній системі координат має вигляд прямої лінії. Користуючись цією кривою, визначають наявність ФВ в досліджувальній плазмі. Для більшої точності останню також можна досліджувати в 2 - 3 розведеннях.
2.3. Дослідження стану місцевої та системної загальної реактивності організму
Усім обстеженим особам робили загальний клінічний аналіз крові [23,101]. Підраховували кількість еритроцитів,