ГЛАВА ІІІ
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
ІІІ.1. Влияние грамицидина S на агрегацию тромбоцитов
ІІІ.1.1. Набухание и изменение формы тромбоцитов при действии грамицидина S. Так как грамицидин S взаимодействует неспецифически с липидным бислоем мембран любых клеток, он может нарушать структуру мембран не только эритроцитов, но и других клеток крови и вызывать изменение их функциональной активности. В связи с этим, представляло интерес изучение влияния грамицидина S на клетки крови, в частности на тромбоциты человека и их функциональную активность.
Характер влияния антибиотика грамицидина S на тромбоциты зависит от концентрации антибиотика. При добавлении грамицидина S в концентрации 5 ? 10-3 мг/мл к ОТП наблюдалось увеличение светопропускания (уменьшение оптической плотности) образца (рис. 3.1). Теоретические расчеты показывают, что набухание клеток ведет к увеличению светопропускания и уменьшению оптической плотности образца [4, 7, 15]. Известно, что грамицидин S вызывает набухание различных клеток и их органелл (например, митохондрий) [3, 20]. Поскольку грамицидин S взаимодействует только с фосфолипидами мембран, его действие на клетки неспецифично и тогда, наблюдаемое увеличение светопропускания образца ОТП, вероятно, связано с набуханием тромбоцитов, индуцированным этим антибиотиком.
При увеличении концентрации грамицидина S (9 ? 10-3 мг/мл) уменьшение оптической плотности сменяется ее увеличением, наступающим через 20 - 60 с (рис. 3.1). Грамицидин S в более высокой концентрации (1 ? 10-2 - 2 ? 10-2 мг/мл) вызывает только увеличение оптической плотности образца. Подобное увеличение оптической плотности характерно для начальной фазы агрегации тромбоцитов.
Рис. 3.1. Набухание и активация тромбоцитов при действии грамицидина S.
Приведены типичные зависимости изменения светопропускания суспензии тромбоцитов под действием грамицидина S с течением времени. Концентрация грамицидина S: (1) - 5 ? 10-3 мг/мл; (2) - 10-2 мг/мл; (3) - 2 ? 10-2 мг/мл. индуцированной АДФ, и объясняется изменением формы клеток от дисковидной к сферической (при неизменном объеме) [4, 16]. Известно, что уменьшение светопропускания ОТП, индуцированное агрегантами, обусловлено структурно-морфологическими изменениями, в результате которых тромбоциты принимают неправильную форму с псевдоподиями [4]. Подобное изменение формы тромбоцитов происходит при их активации. Таким образом, можно предположить, что при определенной концентрации индуцированной АДФ, и индуцированной АДФ, и грамицидин S активирует тромбоциты.
Количественные значения описанных процессов приведены в табл. 3.1.
Таблица 3.1.
Концентрационные зависимости влияния грамицидина S на изменения формы тромбоцитов и степень их агрегации при действии антибиотика
ПоказательКонцентрация грамицидина S, мкМ5,46,27,89,1Число молекул грамицидина
S / тромбоцит ? 10613,01 ± 0,55114,94 ± 0,62918,79 ± 1,12221,92 ± 1,538Максимальное изменение формы тромбоцитов - ?Т,%6,38 ± 0,515*7,68 ± 0,608*, **6,0 ± 0,49**6,0 ± 0,49Максимальное изменение формы тромбоцитов через 7,5 минут - ?Т,%4,13 ± 0,393*1,88 ± 0,147*, **- 0,75 ± 0,061*,*- 2,25 ± 0,153*,**Время начала распада тромбоцитов - сНе
разрушаютсяНе
разрушаются392254Степень агрегации - ?Т,%20,3 ± 2,31*, **15,0 ± 1,26*, **12,0 ± 0,98*11,6 ± 0,85* Примечания: * - достоверно относительно минимальной концентрации грамицидина S (р < 0,05); ** - достоверно относительно предыдущей концентрации грамицидина S (р < 0,05).
Возможно, механизм активации тромбоцитов грамицидином S связан либо с увеличением проницаемости мембраны для ионов Са2+, либо с высвобождением Са2+ из примембранных депо в результате встраивания грамицидина S в мембрану. Участие ионов Са2+ подтверждают наши эксперименты по набуханию тромбоцитов в гипотонической среде. Известно, что при помещении тромбоцитов в гипотоническую среду, содержащую СаСl2 в концентрации 10-3 М/л наблюдается двухфазное изменение светопропускания образца: быстрый рост светопропускания за счет набухания клеток сменяется медленным падением - "обратным ходом" [4]. В отсутствие ионов Са2+ наблюдается только быстрое увеличение светопропускания образца, микромолярные добавки ионов Са2+ приводят к быстрому уменьшению светопропускания [4]. Следует отметить, что при набухании клеток внутриклеточный Са2+ не высвобождается [4, 19]. В наших экспериментах мы получили аналогичные результаты по набуханию тромбоцитов в гипотонической среде, при этом интактность тромбоцитов в гипотонической среде контролировалась по степени их агрегации индуцированной АДФ. При добавлении деионизованной воды к образцу ОТП наблюдалось только увеличение светопропускания без "обратного хода". Отсутствие фазы уменьшения светопропускания подтверждает литературные данные о том, что при набухании тромбоцитов в гипотонической среде Са2+ не высвобождается. При добавлении грамицидина S к тромбоцитам, находящимся в гипотонической среде, наблюдалось резкое уменьшение светопропускания, аналогичное "обратному ходу" в среде, содержащей Са2+. Таким образом, можно предположить, что механизм действия грамицидина S на тромбоциты (механизм активации тромбоцитов грамицидином) опосредован ионами Са2+. Соответствующие данные о влиянии ионов кальция, а также ионов магния на агрегацию тромбоцитов приведены в табл. 3.2 на рис. 3.2.
Для объяснения этих данных следует, прежде всего, отметить, что минеральные вещества, содержащиеся в крови в виде свободных ионов, обуславливают осмотическое давление крови, играют важную роль в водном балансе и поддержании кислотно-основного равновесия. Однако остаётся ещё много неясного в том, какова роль анионов и катионов в процессе свёртывания крови.
Взаимосвязь между действием физиологическими индукторами агрегации и ответной реакцией тромбоцитов достаточно изучена и определяется метаболизмом арахидоновой кислоты, фосфатидилинозитолами, диацилглицеролом и циклическими нуклкотидами и ионами [38, 117, 181]