РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛ, МОДЕЛИ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Характеристика использованного материала и
группировка экспериментов
Эксперименты проведены на 120 половозрелых крысах самцах и 180 половозрелых крысах самках линии Wistar массой 190-250г. Крыс содержали до опыта в условиях вивария при стандартных световом режиме и рационе питания в течение 20-30 дней. Все экспериментальные исследования проведены под контролем комиссии по биоэтике Высшего государственного учебного заведения Украины "Украинская медицинская стоматологическая академия" (протокол №36 от 25.04.06), в соответствии с методическими рекомендациями ГФЦ МЗ Украины "Докликические исследования лекарственных средств" [49].
Основными объектами исследования у экспериментальных животных являлись кровь, ткань семенников и сперма. Эвтаназию экспериментальных животных проводили после суточного голодания, утром, под гексеналовым наркозом (50 мг/кг массы внутрибрюшинно). Крысам вскрывали грудную клетку и через силиконированную иглу из полости левого желудочка отбирали кровь. Семенники быстро извлекали, делали точную навеску 500 мг и готовили гомогенат с фосфатным буфером, который в дальнейшем использовали для исследований. Кровь собирали в пробирки, обработанные цитратом натрия, для определения спонтанного гемолиза эритроцитов и получения плазмы. Семенники фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. Придатки семенников разрезали и бережно гомогенизировали каждый с 2 мл физиологического раствора для подсчета количества сперматозоидов и определения кинезисграммы.
Для определения порогов влияния химических веществ на организм по лимитирующему гонадотоксическому эффекту, использовали экспериментальные подходы, длительность которых согласно существующим методическим разработкам составляет 2-4 месяца для мелких лабораторных животных [49, 143]. Токсическое действие для делящихся клеток сперматогенного эпителия реализуется и проявляет себя очень быстро уже в первых генерациях цикла сперматогенеза. На основании этих результатов был выбран период введения прооксидантов 56 дней. За это время у крыс-самцов происходит трансформация сперматогоний в сперматиды, и в сперматозоиды - 46-48 дней и "дозревание" сперматозоидов в эпидидимусе - 6-8 дней [6, 76, 255]. В этих условиях оценивали гонадопротекторные эффекты природных АО, перечень которых представлен в таблице 2.1.
Таблица 2.1
Препараты АО используемые в эксперименте
№№
п/пПрепарат АОПредприятие, фирма-изготовитель1?-токоферола ацетатЗАО "Киевский витаминный завод", Украина2Эхинацеи пурпурной экстракт жидкийОАО "Лубныфарм",
Украина3Азупростат (?-токоферола ацетат 12 мг; ретинола пальмитат 6500 МЕ.; сухой экстракт травы эхинацеи пурпурной 4,5 мг; ?-ситостерол 65 мг)"Азуфарма",
Германия
Характеристика экспериментальных групп животных представлена в таблице 2.2.
Для определения репродуктивной способности крыс-самцов ссаживали с интактными самками. Об оплодотворении самок судили по наличию сперматозоидов в мазках из влагалища. На 21-й день беременности самок выводили из эксперимента. Для каждой самки учитывалось: общее количество желтых тел в яичниках, количество мест имплантации, количество живых плодов, количество мертвых эмбрионов, количество резорбированных зародышей. На основании этих показателей вычисляли общую эмбриональную смертность и постимплантационную летальность.
Таблица 2.2
Группировка экспериментов
№№
серииПрооксидант, суточная доза, мг/кг массы тела, путь введенияКол-во
жив.Препарат АО
суточная доза, мг/кг массы тела, путь введенияДлит. опыта (дни)1Интактные10--2Интактные10физиологический раствор NaCl, 1мл per os563Ацетат свинца,
60 мг/кг per os20-564Ацетат свинца,
60 мг/кг per os10?-токоферола ацетат, 10 мг/кг
per os565Ацетат свинца,
60 мг/кг per os10Эхинацеи пурпурной экстракт жидкий, 5 мг/кг
per os566Ацетат свинца,
60 мг/кг per os10азупростат, 30 мг/кг
per os567Клопиралид,
150 мг/кг per os20-568Клопиралид,
150 мг/кг per os10?-токоферола ацетат, 10 мг/кг
per os569Клопиралид,
150 мг/кг per os10Эхинацеи пурпурной экстракт жидкий, 5 мг/кг
per os5610Клопиралид,
150 мг/кг per os10азупростат, 30 мг/кг
per os56
2.2. Экспериментальные модели исследования
Гонадотоксический эффект воспроизводился в 3,4,5,6 сериях эксперимента введением ацетата свинца в дозе 60 мг/кг (0,3 LD50) массы тела, ежедневно, per os по методике А.И. Штернберг и соавт. [109]. В 7,8,9,10 сериях эксперимента ежедневно, per os вводился клопиралид в дозе 150 мг/кг массы тела животного, что составило 0,3 LD50 (LD50 5000 мг/кг) [198, 207]. Введение токсикантов проводилось на протяжении 56 дней. При выполнении работы оценивали гонадопротекторные эффекты природных и синтетических АО, перечень которых представлен в таблице 2.1. Проксиданты и исследуемые АО вводились ежедневно, per os, по методике описанной [49], на протяжении всего эксперимента.
Дозы АО препаратов отработаны в лаборатории биохимии и фармакологии антиоксидантов Украинской медицинской стоматологической академии с использованием результатов модельных опытов, острых и хронических экспериментов ?14, 15, 179?, при этом учитывалась цель исследования - изучение профилактического действия АО и их комплекса как гонадопротекторов.
2.3. Биохимические методы исследования
Для проведения биохимических исследований использовалась следующая аппаратура и оборудование: спектрофотометр СФ-46 (Ломо, Россия); центрифуга ОПН-3; весы электронные ВЛ Е-134; колориметр фотоэлектрический концентрационный КФК-2; весы торсионные ВТ-500; термостат ТС-80 и другое лабораторное оборудование.
Через 56 дней опыта в крови и тканях экспериментальных животных определяли биохимические показатели, отражающие уровень СРПО липидов, антиоксидантной обеспеченности и активность АФ. Перечень биохимических методов, а также литературные источники представлены в таблице 2.3.
Содержание диеновых коньюгатов о