РОЗДІЛ 2
ОБ'ЄКТИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Представлений у дисертації експериментальний матеріал одержано в процесі досліджень, які проводили у 2005-2007 роках у відділі симбіотичної азотфіксації Інституту фізіології рослин і генетики Національної академії наук України (ІФРГ НАН України).
2.1. Об'єкти досліджень
У дослідженнях використовували рослини сої Glycine max (L.) Merr. сорту Мар'яна спільної селекції Інституту фізіології рослин і генетики НАН України, Селекційно-генетичного інституту і Інституту землеробства Української академії аграрних наук (УААН), люпину жовтого Lupinus luteus (L.) сортів Промінь і Круглик селекції Інституту землеробства УААН.
У роботі застосовували штами повільнорослих бульбочкових бактерій Bradyrhizobium japonicum (634б, 614а, 631, 622, 646, 606, 603, 102с, W12, К, 71т, 10к, В-1, 69r, G80, М8) та Bradyrhizobium sp. (Lupinus) (371а, 367, 400, 176, 168, 10, 359а) з музейної колекції азотфіксувальних мікроорганізмів ІФРГ НАН України. Tn5-мутанти ризобій одержані методом транспозонового мутагенезу за допомогою плазміди pSUP2021::Tn5 спільно зі співробітниками відділу симбіотичної азотфіксації ІФРГ НАН України.
2.2. Умови проведення досліджень
Мікровегетаційні та вегетаційні досліди проводили на вегетаційному майданчику ІФРГ НАН України. В залежності від завдань досліду вирощували по 6-8 рослин на промитому річковому піску (60 % повної вологоємкості), за умов природного освітлення у 2-, 6-, 8- і 13-кілограмових посудинах Вагнера, які попередньо стерилізували 20 %-ним розчином Н2О2. Джерелом мінерального живлення була суміш Гельрігеля, що містила 0,25 норми азоту (одна норма азоту становить 708 мг Са(NO3)2 · 4Н2О на 1 кг піску) з додаванням мікроелементів В, Мо і Fe. Як контроль використовували вихідні та виробничі штами бульбочкових бактерій сої та люпину.
Насіння сої стерилізували протягом 15 хв 70 %-ним розчином етанолу, після чого 2 год промивали водою. Насіння люпину стерилізували за допомогою 16 %-го пероксиду водню з наступним відмиванням його впродовж години водою. Бульбочкові бактерії вирощували на манітно-дріжджовому агарі (МДА) протягом 8 днів при температурі 28 °С. Бактерії з поверхні МДА змивали стерильною водою. Інокуляцію насіння здійснювали шляхом зволоження його протягом 1 год бактеріальною суспензією із концентрацією 108 кл./мл, після чого насіння висівали у субстрат. При цьому інфекційне навантаження становило 20 тис. кл./насінину.
Відбір зразків для аналізу проводили у фазах появи 3-х справжніх листків, бутонізації і цвітіння. Повторність дослідів 8-10-разова.
Мікропольові досліди закладали на дослідній ділянці ІФРГ НАН України. Ґрунт сірий лісовий, супіщаний, рН 5,9-6,1. Вміст гумусу 1,3-1,6 %, фосфору 9,0-10,3, калію 9,4-10,2, легкогідролізованого азоту 10,4-12,7 мг/100 г ґрунту. Облікова площа ділянки - 2 м2, повторність дослідів - 4-х кратна.
Польові досліди проводили на агробіостанції Уманського державного педагогічного університету ім. П. Тичини (Черкаська обл.). Ґрунт дослідних ділянок темно-сірий опідзолений, рН 5,4-5,7. Вміст гумусу 1,6-2,0 %, фосфору 9,3-12,2, калію 13,1-17,6, легкогідролізованого азоту 12,1-12,7 мг/100 г ґрунту. Облікова площа ділянки 5 м2. Повторність досліду 4-кратна, розміщення дослідних ділянок рендомізоване. Сою висівали з розрахунку 600 тис., люпин - 750 тис. схожих насінин/га. Відбір рослин сої для аналізів проводили у фази 4-го справжнього листка, бутонізації та цвітіння, а рослин люпину - у фази цвітіння та на початку утворення бобів.
2.3. Методи досліджень
Азотфіксувальну (нітрогеназну) активність (АФА) визначали ацетиленовим методом [53, 178]. Коріння з бульбочками поміщали в герметично закриті гумовими мембранами скляні флакони ємкістю 75 см3, в які вводили ацетилен. Кінцева його концентрація у газовій суміші флакона становила 10 %. Тривалість інкубації аналізованих рослинних зразків - 1 година. Після цього газову суміш, яка містила етилен, утворений в результаті редукції ацетилену нітрогеназою, аналізували на газовому хроматографі "Chromatograf - 504" ("Mera Elwro", Польша) з полум`яно-іонізаційним детектором. Розділення газів проводили на колонці (0,40 ·130 см) із Parapac N при температурі 80 ?С. Газоносієм був азот (50 мл за 1 хв). Об'єм аналізованої проби газової суміші становив 0,5?1,0 см3. Як стандарт використовували чистий етилен, одержаний після змішування етилового спирту з концентрованою сірчаною кислотою (1 : 3) та підігрівання до 160 ?С:
С2Н5ОН>С2Н4+Н2О
Етилен очищали послідовним пропусканням через концентровану Н2SO4 та 4н розчин NaOH і зберігали в газометрі над насиченим розчином NaCl. Ацетилен, який використовували в дослідах, одержували шляхом дії води на технічний карбід кальцію:
СаС2+2Н2О>С2Н2+Са(ОН)2
з подальшим очищенням утвореного газу шляхом пропускання його через систему склянок Дрекселя з розчинами-поглиначами: 1) розбавлена водою сірчана кислота (1 : 3) (вилучення ацетону і аміаку); 2) 20%-ний розчин оцтовокислого свинцю або кадмію (вилучення водень-сульфіду); 3) 20%-ний розчин сірчанокислої міді (вилучення фосфіну); 4) активоване вугілля у U-подібній трубці (вилучення ацетону); 5) 20%-ний лужний розчин пірогалолу у 20%-ному розчині гідроксиду калію (вилучення кисню). Одержаний ацетилен зберігали в газометрах над насиченим розчином NaCl.
Робочу калібрувальну суміш готували розведенням етилену повітрям за допомогою шприців у такій послідовності:
2 мл С2Н4+ повітря>50 мл>5 мл +повітря >50 мл
З огляду на молярний об?єм газу ? 22,4 л за нормальних умов (температура 0 ?С, тиск 760 мм ртутного стовпа), ? концентрація етилену в такій суміші становить 176,5 · F нмоль · 1мл, де F - коефіцієнт, що вводить поправку на вміст водяної пари у відібраному об?ємі етилену та переводить цей об?єм до нормальних умов:
F =P?PH2O(1+?t)760
де Р - атмосферний тиск при відбиранні етилену із газометра, мм Hg; PH2O - парціальний тиск водяно