Ви є тут

Фармакогностичне дослідження азуленвміщуючих рослин роду Artemisia L. флори України з метою одержання лікарських засобів протизапальної дії

Автор: 
Гречана Олена Володимирівна
Тип роботи: 
Дис. канд. наук
Рік: 
2008
Артикул:
3408U002565
129 грн
Додати в кошик

Вміст

РОЗДІЛ II
ОБ'ЄКТИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Об'єкти дослідження

У даному розділі приводиться опис методів, приладів і реактивів, що використовувались нами при виконанні експериментальної частини.
Об'єктами вивчення були рослини різних видів роду полин (п. гіркий, п. звичайний, п. австрійський), які нами заготовлялись в Україні у період 2002 - 2006 рр., а також сировина з офіцінальних видів рослин, яку було запаковано в заводських умовах. Досліджувані види найбільш розповсюджені на території південного сходу і центральних районів України та складають основу сировинної бази рослин роду полин (Запорізька, Дніпропетровська, Донецька, Херсонська, Миколаївська, Київська області та АР Крим).

2.2. Методики дослідження
2.2.1. Отримання екстрактів з рослинної сировини

Для виявлення вуглеводів, амінокислот, дубильних речовин, отримували водні екстракти: 50,0 г повітряно - сухої сировини, подрібненої до розмірів часток 2 - 3 мм, заливали 250 мл води і підігрівали на водяному огрівнику із зворотним холодильником. Екстракцію повторювали двічі новими порціями розчинника, випарювали у вакуумі до 100 мл.
Для визначення флавоноїдів, оксикоричних кислот отримували спирто - водні екстракти. Екстракцію 50,0 г сировини проводили 70 % спиртом етиловим аналогічно методиці, наведеній вище. Спирто - водні екстракти об'єднували та концентрували у вакуумі до повного вилучення спирту, охолоджували та відфільтровували осад хлорофілу та ліпофільних сполук. Фільтрат послідовно обробляли розчинниками різної полярності (хлороформ, етилацетат, н - бутанол) для вилучення сполук різної природи. Для цього 30 мл очищеного водного залишку упареного спирто - водного витягу обробляли хлороформом у ділильній лійці 6 - 7 разів порціями у 30 мл. Залишок підігрівали на киплячому водяному огрівнику до зникнення слідів хлороформу, охолоджували і послідовно екстрагували етилацетатом та н - бутанолом. Об'єднавши хлороформну, етилацетатну та бутанольну фракції разом з водним залишком, упарювали у вакуумі до густого залишка. В отриманих фракціях проводили визначення агліконів та глікозидів флавоноїдів, дубильних речовин (етилацетатна та бутанольна фракції) та амінокислот (водний залишок).
Для отримання ліпофільної фракції подрібнену сировину вичерпно екстрагували рослинною олією (кукурудзяною, соняшниковою) на водному огрівнику при температурі 50о С протягом 1 години. Екстрагування нових порцій рослинної сировини повторювали тричі тією - ж наважкою екстрагенту. Нами було отримано ліпофільні фракції з трави п. гіркого, звичайного і австрійського, в склад яких входили флавоноїди, каротиноїди, урсолова кислота та фенолкарбонові кислоти.
Для проведення якісного аналізу на присутність біологічно активних речовин використовували метод ПХ та ТШХ на пластинах "Silufol UV - 254" у відповідних системах розчинників [24, 25, 34].
Для отримання ліофільної фракції нами було розроблено методику сублімаційного сушіння витяжок з рослинної сировини видів роду полин, яку проводили на установці КС - 30 (завод "Фрігера", Чехословаччина).
1. Підготовка витяжок з лікарської сировини.
Водну витяжку з трави полинів (1 : 5) розливали в пляшки місткістю 500 мл та заморожували у спиртовій ванні при температурі - 40о С протягом всього періоду заморожування. Заморожування проводили в горизонтальному положенні пляшок при повільному обертанні навколо своєї осі, при цьому кут між рівнем спирту у ванні і повздовжньою віссю пляшок повинен складати 3 - 5 градусів для того, щоб витяжка не попала в шийку пляшки і не замерзла в ній. Тривалість заморожування - не менше 40 хвилин. Витяжка заморожувалась рівномірним шаром на внутрішній поверхні пляшки. Для кожної сушки витяжки заготовляли 1 - 2 контрольні пляшки, в які уморожували термометри опору для контролю температури витяжок в процесі сушки.
2. "Загартовування" замороженої витяжки.
Після того, як заморожування скінчалось, пляшки старанно протирали від залишків спирту і вміщували в холодильник при температурі - 30о С для "загартовування" і зберігання. Тривалість "загартовування" не менше 12 годин, а термін зберігання не більше 30 днів.
3. Сублімаційна сушка.
Підготовку боксу проводили згідно з "Контролем стерильності консервованої донорської крові, її компонентів, препаратів, консервованого кісткового мозку, кровозамінників та консервуючих розчинів, умовами їх заготівлі", затвердженого МОЗ України, Київ, 1999 р.
Перед завантаженням витяжки внутрішні частини субліматора і касети обробляли 96 % розчином спирту етилового. Касети охолоджували до температури не вище - 30о С. При досягненні касетами необхідної температури, субліматор відкривали. Пляшки з замороженою витяжкою вміщували в гнізда касети і знімали корки, починаючи з більш віддалених рядків.
Після цього субліматор закривали кришкою і вмикали вакуумний насос. При зниженні тиску в субліматорі (10 ± 60 Па), відбувалось зниження температури продукту до - 25 - 50о С. Через 3 години після підключення вакуумного насосу регулятор підігріву встановлювали так, щоб температура замороженої витяжки не перевищувала - 25о С. Відтоді підвищували температуру підігріву касет до + 40о С, щоб температура витяжки в кінцевій фазі висушування не перевищувала + 40о С. Загальна тривалість висушування 29 годин [85].
Вивантаження витяжки проводили в асептичних умовах. Пляшки швидко закривали гумовими корками, починаючи з найближчих рядків в касеті, закупорювали ковпачками і заливали металексом. Вихід сухого порошку з 1 л витяжки не менше 11 г.

2.2.2. Ідентифікація біологічно активних речовин

Для ідентифікації і кількісного аналізу біологічно активних речовин використовували методи хроматографії: на папері, тонкошарових пластинах "Silufol UV - 254" і в незакріпленому шарі сорбенту; хімічні методи аналізу; УФ -, ІЧ - і ПМР - спектроскопію, газорідинну і високоефективну рідинну хроматографію, атомно - адсорбційну спектрометрію, ХМС [22,