РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Клінічні методи обстеження на урогенітальний мікоплазмоз
З метою виконання поставлених нами завдань протягом 3 років комплексно в динаміці було обстежено 152 жінки, у яких виявлено урогенітальний мікоплазмоз (основна група) та 30 практично здорових жінок (контрольна група). Дослідження проводились на клінічних базах кафедри акушерства та гінекології № 1 Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця МОЗ України (гінекологічне відділення пологового будинку № 7 м. Києва та жіночих консультацій Шевченківського та Голсіївського районів м. Києва), а також науково-дослідному лабораторному центрі при Національному медичному університеті та відділі інтерферонів та імуномодуляторів Інституту мікробіології та вірусології ім. акад. Заболотного НАН України.
З метою детального і всебічного вивчення клініко-епідеміологічних особливостей мікоплазмової інфекції нами спеціально розроблена карта-анкета, в яку вносились відомості про скарги на момент обстеження, анамнез життя, статевої функції, відомості про шкідливі звички та професійні шкідливості, характер перебігу захворювання, результати лабораторного дослідження на мікоплазмоз та інші захворювання, що передаються статевим шляхом, соціальна характеристика обстежених.
У таблиці 2.1. представлено відомості, щодо, методів об?єкту і обсягу проведеного нами дослідження.
Таблиця 2.1
Методи і обсяг обстеження
Методи дослідженняОб?єктОбсягСкринінгове первинне обстеження населенняПацієнтки-Комплексне обстеження:
хворі
здоровіПацієнтки152БактеріоскопічнийВиділення362Реакція прямої імунофлюоресценціїЗшкрібок уретри, цервікальний канал, піхва126Культуральний метод "DUO"Виділення236Полімеразна ланцюгова реакціяЗшкрібок уретри, цервікальний канал, піхва164Ультраструктурний методБіоптати шийки матки, піхви6Імунологічний методКров98
До комплексного аналізу обстеження хворих входило:
- вивчення анамнезу життя і хвороби пацієнтів. Особлива увага зверталась на запальні захворювання урогенітального тракту, а також виділення із статевих шляхів, болі, печіння, дизуричні явища;
- візуальна оцінка стану зовнішніх статевих органів: тип оволосіння, ступінь розвитку, наявність кондилом, висипань на статевих органах, та вираженість гіперемії уретри та цервікального каналу;
- вагінальне обстеження урогенітального тракту у жінок;
- обстеження за допомогою загальноклінічних методів: реакція Вассермана, визначення ВІЛ, загальні аналізи крові і сечі, бактеріологічне та бактеріоскопічне вивчення матеріалу з уретри та цервікального каналу жінок.
2.2. Діагностика урогенітального мікоплазмозу
Наявність інфікування урогенітального тракту М.hominis і U.urealyticum у обстежених жінок визначалась трьома методами.
2.2.1.Методика виявлення антигенів М.hominis U.urealyticum в реакції прямої імунофлюоресценції
Використовувались стандартні набори "Микогомослайд" і "Уреаслайд" виробництва "Лабдиагностика" (Російська Федерація). Забір матеріалу для дослідження проводили з слизової оболонки уретри обстежених пацієнтів. Мазок висушивали на повітрі, фіксували 96° етанолом протягом 5 хв. Помічені мікоплазмові антитіла наносили на мазок мікропіпеткою в об'ємі 30 мкл, піддавали інкубації в термостаті при 37°С протягом 15 хв і досліджували в люмінесцентному мікроскопі. М.hominis і U.urealyticum виявлялись у вигляді поліморфних структур з яскраво-зеленим свіченням. Неспецифічна бактеріальна мікрофлора, клітини епітелію і лейкоцити забарвлювались в жовтогарячий та червоно-бурий колір.
2.2.2. Культуральний метод
Використовувались стандартні набори "Мycoplasma Duo" фірми "Saanofi Pasreur". Зрощування мікоплазм проводили в термостаті при Т +36-37°С. Результати враховувались через 24 год для U.urealyticum і через 48 год для М.hominis. При зрощуванні мікоплазм утворюються лужні речовини, які завдяки наявності індикатора змінювали колір середовища від початкового жовтого до рожевого. Перевагою відповідних тест-систем є можливість обліку мікоплазм як у якісному, так і, кількісному (104 КОЕ) варіанті.
2.2.3. Методика полімеразної ланцюгової реакції
Методом ПЛР з застосуванням тест-системи виробництва НВФ "ДНК-Технологія" (Російська Федерація), проводилось дослідження для ідентифікації М.hominis, U.urealyticum, M.genitalium потрібно відзначити, що дослідження на M.genitalium проводилось тільки методом ПЛР. Це пояснюється тим, що інших діагностичних тест-систем для ідентифікації даного виду мікоплазм на теперішній час не існує. Результат вважався позитивним, якщо M.genitalium дворазово діагностувалась в ПЛР і не визначалась іншими методами (РІФ, культуральний).
Матеріалом для проведення дослідження методом ПЛР служили епітеліальні клітини слизової оболонки уретри обстежених нами хворих жінок.
ПЛР складається з трьох етапів: перший - виділення ДНК збудника; другий - ампліфікація виділення ДНК збудника; третій - детекція ДНК збудника.
Під час підрахунку результатів в пробірках з позитивним контролем, який маркований (+) має бути видна одна смуга ДНК, що світиться жовтим кольором, а в пробірці з негативним контролем, яка маркірована (-) не має бути смуги ДНК, що світиться жовтим кольором. Проте за наявності смуги, що світиться жовтим кольором, у негативному контрольному зразку його розглядали як наслідок контамінації. При цьому результаті дослідження не враховуються. При наявності полосок жовтого кольору, які світяться вище і нижче полоски позитивного контролю - це може бути результатом неспецифічної ампліфікації, яка також не береться до уваги.
2.3. Методика електронно-мікроскопічного дослідження
Електронно-мікроскопічним методом ми вивчали біоптати піхви 3 хворих жінок на підгостру форму урогенітального мікоплазмозу, 3 жінок з хронічною та 3 з мікоплазмоносійством. Контролем були біоптати піхви 3 здорових жінок.
Дослідження проводили на базі